Nós relatamos um dispositivo e um novo método para estudar células e embriões. células individuais são precisamente ordenados em matrizes microcavidade. Seu confinamento 3D é um passo para ambientes 3D encontrados em condições fisiológicas e permite a orientação organela. Ao controlar a forma da célula, esta configuração minimiza variabilidade relatados em ensaios convencionais.
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Artigo de método
Ordenando células individuais e único embriões em 3D Confinamento: Um novo dispositivo de alta Screening conteúdo
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células biológicas são geralmente observados em superfícies planas (2D). Esta condição não é fisiológica, e fenótipos e formas são altamente variáveis. A triagem com base em células em tais ambientes têm limitações, portanto, graves: organelas celulares mostram fenótipos extremos, morfologias celulares e tamanhos são organelos celulares heterogêneos e / ou específicos não pode ser correctamente visualizado. Além disso, as células in vivo situam-se num ambiente 3D; Nesta situação, as células mostram diferentes fenótipos principalmente por causa da sua interacção com a matriz extracelular em torno do tecido. A fim de padronizar e gerar fim de células individuais em um ambiente 3D fisiologicamente relevantes para ensaios baseados em células, relatamos aqui a microfabricação e aplicações de um dispositivo para o cultivo in vitro de células 3D. Este dispositivo é composto por uma matriz 2D de microcavidades (tipicamente 10 cavidades 5 / cm2), cada um cheio com células individuais ou embriões. posi celularção, a forma, a polaridade e organização celular interna tornar-se então normalizados mostrando uma arquitetura 3D. Usamos moldagem réplica de padrão de uma matriz de microporos, (PDMS) camada 'eggcups', em um polidimetilsiloxano fina aderiu em uma lamela. Cavidades foram cobertas com fibronectina para facilitar a aderência. As células foram inseridos por centrifugação. A porcentagem de preenchimento foi otimizado para cada sistema que permite até 80%. As células e os embriões viabilidade foi confirmada. Esta metodologia foi utilizada para a visualização dos organelos celulares, tais como aparelhos de Golgi e núcleo, e para estudar processos activos, tais como o encerramento do anel cytokinetic durante a mitose celular. Este dispositivo permitiu a identificação de novas funcionalidades, tais como acumulações periódicas e heterogeneidades de miosina e actina durante o encerramento do anel cytokinetic e fenótipos compactadas para Golgi e alinhamento núcleo. Caracterizamos o método de células de mamíferos, levedura de fissão, brotação de levedura, C. elegans wom adaptação específica em cada caso. Finalmente, as características deste dispositivo torná-lo particularmente interessante para ensaios de rastreio de drogas e medicina personalizada.
Introdução
Actual em ensaios baseados em células in vitro são bidimensional (2D). Esta configuração não é natural para células de mamíferos e, por conseguinte, não é fisiologicamente relevante 1; células mostram uma diversidade de formas, tamanhos e fenótipos heterogêneos. Eles apresentam sérias limitações adicionais quando aplicado para aplicações de rastreio, tais como uma distribuição desordenada dentro do plano e fenótipos extremos de organelos celulares (fibras de stress, em particular). Isto é particularmente importante em ensaios clínicos para o teste de drogas, onde os altos orçamentos são gastos a cada ano. A maioria destas drogas que falha....
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Protocolo
1. Microfabricação de 'Eggcups'
- Fabricação do Mestre: microcavidades matriz
- Aqueça uma bolacha de 3 '' de silício de até 200 ° C para evaporar qualquer presença de umidade.
- Spin-coat uma fina camada de SU-8 fotorresiste. Ajustar o volume da resina e velocidade de centrifugação em função do tipo e espessura do material fotosensitivo desejado. Esta espessura vai ditar a profundidade das 'Eggcups »(CE). Para uma camada de espessura de 30 um e SU-8 2025, spin-coat a 2,800 rpm.
- Pré-coze a bolacha a 65 ° C durante 1 min (passo 1 de 2) para uma espessura SU-8 2,025 camada de 30 um. Adaptar o tempo, dependendo do ti....
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Resultados
Dos eggcups »(CE) são uma metodologia de alto teor-triagem romance que permite a visualização de células orientadas e embriões em um ambiente 3D. Além disso, alguns processos celulares, que são difíceis de observar em culturas 2D padrão (planas), pode ser observada por este novo método. A Figura 1a mostra um resumo do processo de microfabricação CE (ver também a secção 1 em o protocolo acima descrito ). O método é simples, rápido, eficiente e sem qualquer exigência de equipamentos especiais. Fig.......
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Discussão
moldagem réplica foi utilizado a fim de fabricar os Eggcups ''. O processo de fabricação não precisa de uma sala limpa; é fácil e simples, embora alguns prática pode não ser necessária. Em particular, libertando o selo PDMS é a etapa mais importante, a fim de produzir uma grande área de '' Eggcups alta qualidade. Por esta razão, um cuidado especial tem de ser tomada neste passo. Se essa etapa for repetidamente falhando, considere para otimizar os parâmetros do plasma mais limpos antes da silanização e pl.......
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Divulgações
Não temos nada a divulgar.
Agradecimentos
Nós reconhecemos L. Brino (facilidade de Triagem conteúdo IGBMC alta, Illkirch, França) para fornecer-nos com o anticorpo anti-Giantin, M. Labouesse Lab. para C. elegans (IGBMC) e B. Séraphin Lab. para quem gosta de levedura (IGBMC), E. Paluch e A. Hyman para as células HeLa fluorescentes (MPI-CBG, Dresden), J. Moseley (Dartmouth Medical School) e JQ Wu (Ohio State University) para células de levedura de fissão; A. Hoel e F. Evenou para ajudar experimental, C. Rick (IBMC, Estrasburgo, França) para obter ajuda técnica e JC Jeannot (Femto-st, França) para ajudar na microfabricação. Este trabalho foi apoiado por fundos do CNRS, da Universidade de Estrasburgo, C....
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Materiais
2
<<de CO<<<
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| ddH20 (ultrapuro) | Millipore-Use | sempre água fresca. | |
| Parafilm (filme plástico) | Bemis | PM-999 | Cole o Parafilm na bancada do laboratório usando algumas gotas de água e garanta um nivelamento perfeito da superfície. |
| Foto-máscara | Selba | - | http://www.selba.ch |
| Bolacha de silício | Siltronix | - | http://www.siltronix.com/ |
| SU-8 fotorresistente | MicroChem | série 2000 | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| é necessário trabalhar em um exaustor; consulte a folha de dados do fabricante para obter mais informações. | |||
| Desenvolvedor SU-8 | MicroChem | - | http://microchem.com/Prod-Ancillaries.htm |
| trabalhar em uma capela é necessário; consulte a folha de dados do fabricante para obter mais informações | |||
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 19030 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/i9030?lang=en& region=CA |
| Disponível em várias empresas. | |||
| Sigmacote (reagente siliconizante) | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr& região=FR">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/sl2?lang=fr& região=FR |
| prejudicial, é necessário trabalhar em uma capela; consulte a ficha técnica do fabricante para obter mais informações. | |||
| Clorotrimetilsilano (TMCS) | Sigma-Aldrich | 386529-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/386529?lang=fr®ion=FR |
| TMCS produz inalação aguda e toxicidade dérmica, e é altamente inflamável (com flashback de ignição capaz de ocorrer a distâncias consideráveis), conseqüentemente deve ser usado em uma capela de exaustão longe de fontes de ignição | |||
| Luvas de nitrilo | Kleenguard | 57372 | http://www.kcprofessional. com/products/ppe/hand-gloves/thin-mil-/57372-kleenguard-g10-blue-nitrile-gloves-m |
| Disponível em várias empresas. | |||
| Lamínulas de vidro #0 | Vidro Knittel | KN00010022593 | http://www.knittelglass.com/index_e.htm |
| Muito frágil. Manipule suavemente. | |||
| Pinça reta afiada | SPI | 0WSSS-XD | http://www.2spi.com/catalog/tweezers/t/elec7 |
| tubo de 50 ml | BD Falcon | 352070 | http://www.bdbiosciences.com/cellculture/tubes/features/index.jsp |
| Disponível em várias empresas. | |||
| Kit PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 < | a href="http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx? R=131EN">http://www.dowcorning.com/applications/search/default.aspx? R=131EN |
| O pacote contém a base PDMS e o agente de cura. Elastômeros semelhantes estão disponíveis em várias empresas. | |||
| Lâminas de vidro para microscópio | Dutscher | 100001 | http://www.dutscher.com/frontoffice/search |
| Disponível em várias empresas. | |||
| Meio DMEM com alto teor de glicose | Fisher Scientific | 41965-039 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search? LBCID=12301479& palavra-chave = 41965-039 & store=Scientific& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD |
| Soro de bezerro bovino | Sigma-Aldrich | C8056-500ML | a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en& região=CA">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8056?lang=en& região = CA < / a > |
| 0,25% Tripsina-EDTA | Fisher Scientific | 25200-072 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=25200-072& store=Scientific& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD |
| PBS 1x | Fisher Scientific | 14200-067 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=14200-067& store=Scientific& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD |
| PBS está em 10x e deve ser diluído para 1x usando o meio ddH2O | |||
| L-15 | Fisher Scientific | 21083-027 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=21083-027& store=Scientific& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=PROD |
| Medium para atmosferas sem controle | |||
| Fibronectina | Sigma-Aldrich | F1141-5MG | a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& termo = F1141-5MG & lang=pt-br& região = CA & foco = produto & N=0+220003048+219853082+219853286& modo=correspondência%20parcialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& termo = F1141-5MG & lang=pt-br& região = CA & foco = produto & N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax |
| Penicilina & Estreptomicina | Fisher Scientific | 15140-122 | http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/Search?keyWord=15140-122& store=Scientific& nav=0& offSet=0& storeId=10652& langId=-1& fromSearchPage=1& searchType=CHEM |
| Placa de Petri P35 | Greiner | 627102 | http://www.greinerbioone.com/en/row/articles/catalogue/article/144_11/12885/ |
| Placa de Petri P60 | Greiner | 628163 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/145_8_bl/24872/ |
| Placa de Petri P94 | Greiner | 633179 | http://www.greinerbioone.com/nl/belgium/articles/catalogue/article/146_8_bl/24882/ |
| Paraformaldeído 3 % | Sigma-Aldrich | P6148-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p6148?lang=fr& região=FR |
| Nocivo em particular para os olhos, é necessário trabalhar em uma capela; consulte a ficha técnica do fabricante para obter mais informações. | |||
| Tritão 0,5 % | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& termo = 93443-100ML & lang=pt-br& região = CA & foco = produto & N=0+220003048+219853082+219853286& modo=correspondência%20parcialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& termo = 93443-100ML & lang=pt-br& região = CA & foco = produto & N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax |
| Phallodin-Green Fluorescente Alexa Fluor 488 | InVitrogen | A12379 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/A12379? CID=search-a12379 |
| dissolver o pó em 1,5 ml de metanol | |||
| Alexa Fluor 647 | InVitrogen | A21245 | diluição 1:200 em PBS 1x |
| policlonal de coelho anti-Giantin | Abcam | ab24586 | diluição 1:500 em PBS |
| 1xhttp://www.abcam.com/giantin-antibody-ab24586.html < / a> | |||
| rabbit anti-anilina | Cortesia de M. Glotzer, publicado em Piekny, A. J. & amp Glotzer, M. A anilina é uma proteína de andaime que liga RhoA, actina e miosina durante a citocinese. Biologia atual 18, 30– 6 (2008). | Diluição 1:500 em PBS 1x | |
| Anti-fosfotirosina | Transdução Lab | 610000 | http://www.bdbiosciences.com/ptProduct.jsp?ccn=610000 |
| Cy3 anti-coelho para cabras | Jackson Immunoresearch | 111-166-047 | http://www.jacksonimmuno.com/catalog/catpages/fab-rab.asp |
| 1:1.000 diluição em PBS 1x | |||
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8417?lang=fr& região=FR < / a > |
| 1 mg / ml por 1 min | |||
| de glicerol | Sigma-Aldrich | G2025 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& termo = G2025 & lang=pt-br& região = CA & foco = produto & N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax |
| Óleo mineral | Sigma-Aldrich | M8410-500ML | a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& termo = M8410-500ML & lang=pt-br& região = CA & foco = produto & N=0+220003048+219853082+219853286& modo=correspondência%20parcialmax">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?interface=All& termo = M8410-500ML & lang=pt-br& região = CA & foco = produto & N=0+220003048+219853082+219853286& mode=match%20partialmax |
| Células HeLa | - | Células de mamíferos estão disponíveis em muitas empresas. Veja também Tabela 1 | |
| NIH3T3 células | ATCC-Mammalian | estão disponíveis em muitas empresas. Veja também Tabela 1 | |
| Levedura de fissão | - | - | Para detalhes sobre cepas, entre em contato com o autor correspondente. Veja também Tabela 1 |
| C. elegans worms | - | - | Para obter detalhes, entre em contato com o autor correspondente. Veja também Tabela 1 |
| YES (Agar) + 5 Suplementos incluídos | MP Biomedicals | 4101-732 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-732& s=Pesquisar |
| Para preparação: siga as instruções fornecidas na caixa | |||
| SIM (Mídia) + 5 Suplementos incluídos | MP Biomedicals | 4101-522 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4101-522& s=Pesquisar |
| Para preparação: siga as instruções fornecidas na caixa | |||
| EMM (Mídia) | MP Biomedicals | 4110-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4110-012& s=Pesquisar |
| Para preparação: siga as instruções fornecidas na caixa | |||
| EMM esterilizado por filtro (Mídia) - Somente para imagens | MP Biomedicals | 4110-012 | Para preparação: siga as instruções fornecidas na caixa. Esterilize o filtro usando um 0.22 µ m em vez de autoclavagem. Isso dá transparência ao meio e reduz a autofluorescência. |
| Suplementos (para EMM) | MP Biomedicals | 4104-012 | http://www.mpbio.com/search.php?q=4104-012& s=Pesquisar |
| ( Adicione 225 mg/L ao meio EMM antes de autoclavar ou filtrar) | |||
| Filtros estéreis acionados por vácuo Stericup e Steritop | Millipore | - | http://www.millipore.com/cellbiology/flx4/cellculture_prepare& tab1=2& tab2=1#tab2=1:tab1=2 |
Referências
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Thery, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab Chip. 9, 1640-1642 (2009)....
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Reimpressões e permissões
