고립 된 미토콘드리아의 유동 세포 계측법에 의해 외부 막 단백질의 면역
Summary
여기서 설명하는 것은 감지하고 유세포 짐승 조직으로부터 분리 및 분석 미토콘드리아 immunolabeling 의해 미토콘드리아 외막 단백질을 정량하는 방법이다. 이 방법은 미토콘드리아 개체군의 기능적 측면을 평가하기 위해 확장 될 수있다.
Abstract
방법은 검색과 동물의 조직은 미토콘드리아 생리학 및 병태 생리를 연구하는 필수적인 미토콘드리아 외막 단백질 구성 요소를 모니터링 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 쥐의 조직에서 분리 된 미토콘드리아가 immunolabeled 및 유동 세포 계측법에 의해 분석하는 기술에 대해 설명합니다. 미토콘드리아는 설치류 척수로부터 단리 미엘린, 신경 조직으로부터 제조 미토콘드리아 분획의 주요 오염 물질을 제거하기 위하여 빠른 농축 공정을 실시한다. 고립 된 미토콘드리아는 다음 선택의 항체와 형광 접합 된 이차 항체로 표시되어 있습니다. 유동 세포 계측법에 의한 분석은 검출 및 immunolabeled 단백질의 정량 하였다 미토콘드리아 특정 염료로 염색하여 미토콘드리아 제제의 상대적 순도를 검증한다. 이러한 기술은 샘플 당 미토콘드리아 수십만의 분석을 허용 급속한 정량화 및 높은 처리량이다. 이 소설의 페이지를 평가에 적용 할 수있다정상적인 생리적 조건하에 미토콘드리아 표면 roteins뿐 아니라 병리 과정이 소기관에 mislocalized 될 수 단백질. 중요한 것은,이 방법은 미토콘드리아 개체군의 특정 활동에 대한보고를 형광 표시 염료에 결합 및 중추 신경계 (뇌와 척수)뿐만 아니라 간에서 미토콘드리아에 대한 가능하다 할 수있다.
Introduction
미토콘드리아는 높은 에너지 수요의 사이트로 이송 및 생리 학적 자극 하나에 빠르게 반응하는 핵분열 및 융합의 여러 라운드를 거쳐 매우 동적 인 세포 소기관이다. 그것이 점점 다른 조직에서 미토콘드리아를 인식하고 있기 때문에, 심지어 다른 세포 구획, 새로운 방법은 이러한 고유 한 미토콘드리아의 하위 집합을 식별하는 데 필요한 별개의 기능 프로파일을 가지고있다.
현미경 개별 미토콘드리아가 가시화 될 수있다 수단 및이 면역에 의해 결정될 수있다이나 미토콘드리아에서 단백질의 존재를 제공한다. 그러나,이 방법에 의해 정량 분석은 노동 집약적이고, 일차 또는 무한 증식 세포주를 이용한 실험에 더 적합하다. 조직에서 파생 된 개별 미토콘드리아의 연구는 훨씬 더 어렵고 대부분의 방법은 evalu과 동시에 미토콘드리아 부분 집합을 쉽게 식별 할 수 있도록하지 않습니다미토콘드리아 기능 3의 ation.
이 장애물, 유동 세포 계측법에 의해 짐승 조직으로부터 분리 및 후속 분석 미토콘드리아 immunolabel하는 신규 한 방법을 해결하기 위해 개발되었다. 이는 신속한 검출 및 현미경으로 분석하여 비교 미토콘드리아 외막으로 지역화 단백질의 정량화를 허용 훨씬 덜 노동 집약적이고, 단일 샘플에서 미토콘드리아의 수천의 분석을 허용한다. 이 분석은 미토콘드리아에서 항시 존재하는 것으로 생각되는 미토콘드리아 외막 단백질의 거동 및 상대적인 양을 모니터에 적용 할 수있는, 미토콘드리아 표면 단백질의 채용, 또는 병리학 적 조건의 미토콘드리아에 mislocalized 단백질의 검출. 또한, 종래의 형광 인디케이터 염료의 혼입은 별개의 미토콘드리아에서 미토콘드리아 기능의 특정 측면의 동시 평가를 가능하게소집단.
Protocol
Representative Results
Discussion
이는 미토콘드리아가 정상적인 생리와 질병 모두에서 핵심 선수임을 점점 더 분명하다. 면역 블로는 특정 조건에서 미토콘드리아 내에서 또는 미토콘드리아 표면에 전체 인구의 평균이 방법 보고서를 발견되는 단백질을 확인할 수있다. 이 방법은 미토콘드리아 개체군 또는 부분 집합의 상대적 농도에 대한 정보를 얻을 수 없습니다. 이 왔지만 이전에 모든 미토콘드리아가 동등하게 필드가 점점 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 흐름 cytometer에 액세스 로리 Destroismaisons과 뛰어난 기술 지원을 사라 Peyrard 및 Dr.Alexandre 프라 감사합니다. 우리는 또한 준비에서 수초의 제거에 대한 그의 기여에 대한 박사 티모시 밀러를 인정하고 싶습니다. 이 작품은 건강 연구 (CIHR) 신경 근육 학 연구 파트너십, 혁신에 대한 캐나다 재단, 캐나다의 ALS 협회, ALS 연구를위한 프릭 재단, 미끼 재단과 퐁 드 라 공들인 엉 상테 퀘벡 (CVV)의 캐나다 연구소에 의해 지원되었다. 두 CVV 및 NA는 연구 학자 퐁 드 라 공들인 엉 상테 퀘벡 및 CIHR 새로운 수사. SP 캐나다의 ALS 협회에서 팀 노엘 재학 지원됩니다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rats | Charles River | Strain code 400 | Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used. |
| Dounce homogenizer | Kontes Glass Co. | 885450-0022 | Duall 22 |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend Micro 17 R | |
| Ulara-Clear Ultracentrifuge tubes | Beckman Coultier | 344057 | Transparent, thin walled |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall WX UltraSeries | |
| AH-650 rotor and buckets | Thermo Scientific | ||
| Opti-prep | Axis-Shield | 1114542 | Iodixanol, density gradient medium |
| Fatty acid free Bovine Serum Albumin | Sigma | A8806 | Must be fatty acid free for mitochondria |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S9637 | |
| Rabbit anti-Mitofusin2 antibody | Sigma | M6319 | |
| Rabbit IgG | Jackson Immuno Research | 011-000-003 | |
| Anti-Rabbit IgG PE | eBioscience | 12-4739-81 | |
| Micro titer tube | Bio-Rad | 223-9391 | For sample acquisition by flow cytometry |
| MitoTrackerGreen (MTG) | Invitrogen | M7514 | 100 nM: Ex490 nm/Em516 nm |
| TMRM | Invitrogen | T668 | 100 nM: Ex548 nm/Em574 nm |
| CCCP | Sigma | C2759 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | 5 µM: Ex540 nm/Em600 nm |
| Antimycin A | Sigma | A8874 | |
| LSR II flow cytometer | BD | ||
| BS FACSDiva Software | BD | ||
| FlowJo | TreeStar Inc. | Software used for analysis | |
| BCA protein assay kit | Pierce/Thermo Scientific | 23225 | Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS |
Referências
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