Descrevemos aqui um método melhorado de transferência de luminescência Ressonância Energia (lRet) onde é considerado um local de clivagem da protease entre os locais fluoróforo doador e receptor. Esta modificação permite a obtenção de sinais lRet específicas decorrentes de proteínas de membrana de interesse, permitindo o estudo de proteínas de membrana, sem purificação de proteínas.
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Artigo de método
Luminescência Ressonância transferência de energia para estudar mudanças conformacionais na membrana proteínas expressas em células de mamíferos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Transferência de Energia de Ressonância de luminescência, ou lRet, é uma técnica poderosa usada para medir as distâncias entre dois locais em proteínas dentro da gama de distâncias de 10-100 Â. Ao medir as distâncias em várias condições de ligadura, alterações de conformação da proteína pode ser facilmente avaliada. Com lRet, um dos lantanídeos, térbio na maioria das vezes quelatados, é usado como o fluoróforo doador, proporcionando vantagens como uma vida mais apenas doadores de emissões, a flexibilidade de usar vários fluoróforos aceitador, ea oportunidade de detectar emissões aceitante sensibilizado como uma maneira fácil para medir a transferência de energia, sem o risco de também a detecção de sinal único doador. Aqui, nós descrevemos um método para usar em proteínas de membrana lRet expressas e ensaiadas na superfície de células de mamífero intactas. Nós introduzimos um site protease de clivagem entre o par fluoróforo lRet. Depois de obter o sinal de lRet inicial, a clivagem no local que remove o sinal lRet específica da proteína deinteresse que nos permite quantitativamente subtrair o sinal de fundo que permanece após a clivagem. Este método permite medições mais fisiologicamente relevante para ser feito sem a necessidade de purificação da proteína.
Introdução
Transferência de luminescência Ressonância Energia (lRet) é um derivado do conhecido Transferência de fluorescência Resonance Energia (FRET) técnica 1. Semelhante a FRET, lRet pode ser usado para medir as distâncias e as alterações da distância entre dador e aceitador fluoróforos ligados a sítios específicos da proteína de interesse dentro do intervalo de 10-100 Â 1-3. Os princípios da lRet também são semelhantes aos FRET em que a transferência de energia de ressonância ocorre entre dois fluoróforos proximais quando o espectro de emissão do fluoróforo dador sobrepõe-se com o espectro de absorção do fluoróforo aceitador. A eficiência de transferê....
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Protocolo
1 Criar a construção contendo a proteína de interesse
Clonar o gene que expressa a proteína de interesse num vector adequado. Utilização de vectores como os da série pcDNA ou pRK5 como eles estão bem adaptados para a expressão em sistemas de mamífero, como as células CHO e HEK293.
2 Selecione os locais da proteína a ser identificada com o fluoróforos
- Escolha locais de etiquetagem que é capaz de reflectir as alterações conformacionais possíveis dentro da proteína. Se possível, utilizar uma estrutura de cristal da proteína ou de uma proteína homóloga para ajudar a fazer esta determinação. Se não há estr....
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Resultados
Uma medição lRet sucesso com um doador de lantanídeos devem ter um só doador vida no intervalo de tempo em milisegundos. O tempo de vida de emissão lRet sensibilizado para a proteína marcada com o dador e o aceitador será notavelmente mais curta, com um tempo de vida na gama de microsegundos após subtracção do fundo da Figura 3. Protease clivagem resulta num aumento do tempo de vida que deve tornar-se estável ao longo do tempo ( ou seja, já não mudar), demonstrando que a clivagem de protease es.......
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Discussão
LRet é uma técnica poderosa que permite aos cientistas para medir as distâncias entre os domínios dentro de uma única proteína, bem como entre as subunidades de uma proteína multimérica. Como tal, lRet é bem adequado para examinar as alterações da conformação e da dinâmica de proteínas ou outras macromoléculas. O protocolo acima deve permitir que o laboratório devidamente equipado para testar facilmente suas hipóteses; no entanto, existem muitas fontes comuns de erro que podem flagelar o novo investigador. Se o sinal de.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health Grant GM094246, a American Heart Association Grant 11GRNT7890004, ea National Science Foundation Grant MCB-1110501.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| LanthaScreen Thiol Reactive Tb Chelate | Life Technologies | PV3579 | |
| Aceitador fluoróforo-Fluoresceína-5-Maleimide | Life Technologies | F-150 | A escolha do aceptor depende do experimento específico |
| Aceitador fluoróforo-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide | Life Technologies | A-10254 | A escolha do aceptor depende do experimento específico |
| Aceitador fluoróforo-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20346 | A escolha do aceptor depende do experimento específico |
| Aceitador fluoróforo-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide | Life Technologies | A-10256 | A escolha do aceptor depende do experimento específico |
| Aceitador fluoróforo-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20344 | A escolha do aceptor depende do experimento específico |
| O Espectrofluorômetro Internacional | Photon Technology | deve ter excitação pulsada com a capacidade de medir o tempo de vida na faixa de milissegundos Software | |
| FluoreScan 2.0 | Photon Technology | usado no manuscrito. Software fornecido com o instrumento de fluorescência | |
| Origin 8.6 | OriginLab | Origin é o software de análise de dados usado no protocolo. Pode usar outro software de análise de dados semelhante | |
| Cubeta de quartzo | Starna Cells, Inc | 3-Q-10 | |
| Barra de mexer | Bel-Art Products | F37119-0007 | Usado em cubeta para manter as células em suspensão. Pode usar qualquer barra de agitação que se encaixe na cubeta |
Referências
- Selvin, P. R. Principles and biophysical applications of lanthanide-based probes. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 275-302 (2002).
- Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer:....
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Reimpressões e permissões
