In tempo reale Imaging del trasporto assonale di Quantum Dot-etichettato BDNF in neuroni primari
Summary
Il trasporto assonale di BDNF, un fattore neurotrofico, è fondamentale per la sopravvivenza e la funzione di diverse popolazioni neuronali. Alcune malattie degenerative sono contrassegnate dalla rottura della struttura e funzione assonale. Abbiamo dimostrato le tecniche utilizzate per esaminare il traffico in tempo reale di QD-BDNF in camere di microfluidica con neuroni primari.
Abstract
BDNF svolge un ruolo importante in molti aspetti della sopravvivenza neuronale, la differenziazione e la funzione. Deficit strutturali e funzionali in assoni sono visti sempre più come una caratteristica precoce di malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer (AD) e la malattia di Huntington (HD). Per quanto ancora poco chiaro è il meccanismo (s) di cui danno assonale è indotta. Abbiamo riportato lo sviluppo di una nuova tecnica per produrre biologicamente attivo, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) che può essere utilizzato per tracciare il trasporto assonale di BDNF. Quantum dot-marcato BDNF (QD-BDNF) è stato prodotto da coniugando quantum dot 655 a mBtBDNF. Un dispositivo di microfluidica è stato utilizzato per isolare gli assoni da corpi cellulari dei neuroni. L'aggiunta di QD-BDNF al compartimento assonale consentito l'imaging dal vivo di trasporto BDNF negli assoni. Abbiamo dimostrato che QD-BDNF spostato in sostanza esclusivamente retrograda, con pochissime pause, ad una velocità di spostamento di circa 1,06 micron / sec. Questo sistema può essere usato per studiare mechanisms di perturbato funzione assonale in AD o HD, così come altre malattie degenerative.
Introduction
I neuroni sono cellule altamente polarizzate i cui processi lunghi e spesso altamente elaborati sono fondamentali per stabilire e mantenere la struttura e la funzione dei circuiti neurali. L'assone svolge un ruolo fondamentale nel portare carichi da e sinapsi. Le proteine e organelli sintetizzati nel soma cellulare devono essere trasportati attraverso gli assoni per raggiungere il terminale presinaptico per supportare la funzione neuronale. Di conseguenza, i segnali ricevuti assoni distali devono essere trasdotte e convogliati al soma. Questi processi sono essenziali per la sopravvivenza neuronale, la differenziazione e la manutenzione. In tale trasporto assonale in alcuni neuroni deve essere condotta attraverso distanze più di 1.000 volte il diametro del corpo cellulare, la possibilità è facilmente previsto che anche i piccoli deficit potrebbero avere un impatto marcatamente funzione neuronale e del circuito.
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), un membro della famiglia dei fattori di crescita neurotrofina, è presente in maregioni cerebrali ny, tra cui l'ippocampo, la corteccia cerebrale, e prosencefalo basale. BDNF svolge un ruolo cruciale nella formazione conoscenza e la memoria sostenendo la sopravvivenza, la differenziazione e la funzione dei neuroni che partecipano a circuiti cognitivi. BDNF si lega al suo recettore, il TrkB tirosina chinasi, al terminale dell'assone dove attiva vie di segnalazione TrkB-mediata, tra cui la proteina chinasi attivata da mitogeni / extracellulare proteina chinasi segnale-regolata (MAPK / ERK), fosfatidilinositolo-3-chinasi (PI3K) e fosfolipasi C-gamma (PLCγ). Le proteine che partecipano a queste vie di segnalazione sono confezionati su strutture vescicolari endocitiche per formare il BDNF / TrkB segnalazione endosome 1-6 che vengono poi retrograda trasportato al soma neuronale.
La camera di coltura microfluidica è una piattaforma molto utile per studiare biologia assonale in condizioni normali sia in ambito di lesioni e malattia 7,8. Con assoni isolantidai corpi cellulari, il dispositivo ha permesso di studiare un trasporto specificatamente assoni 8-10. Le piattaforme basate microfluidica PDMS con 450 micron barriere microsolchi utilizzati in questo studio sono stati acquistati in commercio (vedi tabella Materials). Per esaminare i trasporti BDNF, abbiamo sviluppato una nuova tecnologia per la produzione di monobiotinylated BDNF (mBtBDNF). Abbiamo approfittato del peptide biotina accettore, AP (noto anche come AviTag). Si tratta di una sequenza di acido 15 aminoacidi che contiene un residuo di lisina che possono essere specificamente ligato ad un biotina dal coli ligasi enzima biotina Escherichia, Bira. Abbiamo fuso il AviTag al C-terminale del mouse pre-proBDNF cDNA mediante PCR (Figura 1A). Il costrutto è stato clonato nel vettore di espressione di mammifero, pcDNA3.1-myc suo vettore. Abbiamo anche clonato il DNA batterico Bira nel pcDNA3.1-myc suo vettore. I due plasmidi sono stati transitoriamente co-trasfettate in cellule HEK293FT di esprimere entrambe le proteine. Bira catalizzata la legatura di Biotin particolare per la lisina risiedere nel AviTag al C-terminale di BDNF in un rapporto 1: 1 per produrre monobiotinylated BDNF monomero. Biotinilato, maturo BDNF con una massa molecolare di circa 18 kDa è stato recuperato e purificato dal supporto utilizzando Ni-resina (Figura 1C). La biotinilazione di BDNF era completa, come giudicato dalla incapacità di rilevare non modificato BDNF mediante immunoblotting (Figura 1D). Streptavidina punti quantici coniugati QD 655, sono stati usati per etichettare mBtBDNF per fare QD-BDNF. La presenza del AviTag non interferisce con l'attività di BDNF come mBtBDNF era in grado di attivare TrkB fosforilata (Figura 1E) e stimolare la crescita dei neuriti (Figura 1F) nella misura del BDNF umano ricombinante (rhBDNF). Immunostaining dimostrato che QD-BDNF colocalizzava con TrkB in assoni ippocampali, indicando che QD-BDNF è bioattivo (Figura 1G). Per studiare il trasporto BDNF, QD-BDNF è stato aggiunto al compartimento assonale distale diculture microfluidica contenenti ratto E18 neuroni dell'ippocampo (Figura 2A). QD-BDNF trasporto retrogrado all'interno di assoni è stato catturato da in tempo reale di immagini dal vivo del tag fluorescente rossa (supporto video S1, S2). Analizzando il chimografo generato, QD-BDNF è stato osservato per essere trasportato retrograda ad una velocità di movimento intorno 1,06 micron / sec (Figura 3A). GFP o mCherry-tagged BDNF sono stati utilizzati per tracciare il movimento assonale di BDNF. I principali svantaggi sono che non sono abbastanza luminose per gli studi di singola molecola. Inoltre, la presenza di entrambi anterograda e movimenti retrogradi BDNF rende difficile valutare se il BDNF retrograda trasportato era in un complesso neurotrofina / recettore.
In questo video, dimostriamo le tecniche utilizzate per esaminare il traffico in tempo reale di QD-BDNF in camere di microfluidica con neuroni primari. Il ultrabrightness ed eccellente fotostabilità dei punti quantici makes 'possibile effettuare il monitoraggio a lungo termine del trasporto BDNF. Queste tecniche possono essere sfruttati per migliorare gli studi di funzione assonale in AD, HD, e altre patologie neurodegenerative.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, riportiamo lo sviluppo di una nuova tecnica per produrre biologicamente attivo, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) che può essere utilizzato per tracciare il trasporto assonale di BDNF. Con coniugando la proteina di quantum dot streptavidina, e l'utilizzo di una camera microfluidica, il metodo permette di rilevare il trasporto assonale di BDNF in neuroni primari con sensibilità singola molecola, in tempo reale e con risoluzioni spaziali e temporali. Gli strumenti utilizzati in questo documento forni…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Yue (Pauline) Hu, Rachel Sinit per la loro assistenza tecnica. Lo studio è supportato da NIH concedere (PN2 EY016525) e da un finanziamento di Down Syndrome Research Foundation e il trattamento e la Larry L. Hillblom Fondazione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| Platinum pfx DNA polymerase | Invitrogen | 11708021 |
| EcoRI | Fermentas | FD0274 |
| BamHI | Fermentas | FD0054 |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R70007 |
| DMEM-high glucose media | Mediatech | 10-013-CV |
| d-biotin | Sigma | B4639 |
| TurboFect | Fermentas | R0531 |
| PMSF | Sigma | P7626 |
| aprotinin | Sigma | A6279 |
| Ni-NTA resins | Qiagen | 30250 |
| protease inhibitors cocktail | Sigma | S8820 |
| silver staining kit | G-Biosciences | 786-30 |
| human recombinant BDNF | Genentech | |
| Microfluidic chambers | Xona | SND450 |
| 24×40 mm No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-060 |
| poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 |
| HBSS | Gibco | 14185-052 |
| DNase I | Roche | 10104159001 |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 |
| GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 |
| B27 | Gibco | 17504-044 |
| QD655-streptavidin conjugates | Invitrogen | Q10121MP |
| anti-Avi tag antibody | GenScript | A00674 |
| streptavidin-agarose beads | Life Technology | SA100-04 |
| trichloroacetic acid | Sigma | T6399 |
| HRP-streptavidin | Thermo Scientific | N100 |
| anti-pTrkB antibody | a generous gift from Dr M. Chao of NYU | |
| anti-TrkB antibody | BD Science | 610101 |
Referências
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