Protein Isolasjon fra utviklings Embryonic Mouse hjertet ventil Region

Summary

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Abstract

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 μg of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

Introduction

Å være i stand til å identifisere og kvantifisere protein ekspresjonsnivåene er en standard teknikk for dyre-og cellebaserte forsøk. Men til tross for en langvarig interesse for tidlig embryohjerteventil utvikling, evaluere protein uttrykk i denne spesifikke vev under utviklingen er foreløpig begrenset til immunhistokjemi i både dama og mus ^1,2. En del av vanskeligheten med å kvantifisere protein ekspresjon i utviklings ventiler i de fleste modellorganismer (f.eks chick og mus) er den lille størrelsen av ventilene, som begrenser mengden av protein som kan oppnås. Således, for kvantitative analyser, forskere typisk avhengige RNA-ekstraksjon og etterfølgende forsterkning for kvantitativ PCR eller mikromatriseanalyse ^2-5. Men RNA og protein uttrykk nivåer er ikke helt samsvarende ^6, så fokus på RNA uttrykk kan ikke gi en grundig redegjørelse for de mange endringene som skjer i enhver signalepathway på ulike tidspunkter i løpet av utviklingen. Basert på denne grensen i tiden tilgjengelig metodikk, målet med denne prosedyren var å utvikle en protokoll for pålitelig skaffe tilstrekkelige mengder protein fra utviklings embryonale mus hjerteventil regioner for kvantitativ analyse av endringene som skjer i ulike signalveier som er viktige i modningen av dette vevet.

Embryonale ventiler er allerede vanlig dissekert fra mus for RNA isolering og påfølgende analyse av genuttrykk ^2-5. Imidlertid har disse studier vært begrenset til å bruke gen-ekspresjon som et lese-av signalveien aktivering, som ikke tillater påvisning av detektere post-translasjonelle modifikasjoner protein som kan påvirke nedstrøms signalisering. Bruke RNA isolasjon teknikker som utgangspunkt, begynte vi med å dissekere regionene av interesse. Fordi vår interesse var å påvise fosforylerte proteiner som var veiledende signal pathway aktivitet i løpet av en bestemt periode med aortaklaffen utvikling (E13.5-14.5), vi utførte alle disseksjoner i fosfatfritt Tris buffer og samlet inn ventilene i en Tris-basert lysis buffer med fosfatase og proteasehemmere. I vårt spesifikke tilfellet, kun aortaventilen regionene ble oppsamlet, men lunge ventilen regionen kan lett oppnås på samme tid. Ventil regioner ble deretter homogenisert og kombinert med en prøvebuffer som i dag brukes for å studere protein uttrykk hos voksne hjerteklaffene ^7. Ved hjelp av små prøvevolumer (f.eks 2 liter) og pooling ventil regioner fra embryo med samme genotype, var vi i stand til å oppdage fosforylerte og nonphosphorylated proteiner på embryonale dag 13,5 ^8. Fordi ventil regioner kan fryses og lagres i lyseringsbuffer, kan embryoene bli genotypet om nødvendig før sammenslåing.

Denne teknikken utvider sett med verktøy som er tilgjengelig for å vurdere celle signaling trasé under utvikling og gir en kvantitativ kompliment til immunhistokjemi, spesielt for utviklingshjerteklaffene. Denne teknikken bør være til nytte ikke bare for utviklings kardiologer, men også til alle utviklings biologer som arbeider med tidlig stadium embryoer er interessert i regioner som inneholder begrenset vev.

Protocol

MERK: Alle forsøkene ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of North Carolina i Chapel Hill. 1. Vesenet aortaklaffen Ved hjelp av en godkjent dødshjelp teknikk for fosterstadiet av interesse, avlive en gravid mus med unger i ønsket embryonale dag (E) av utviklingen. Bruk 70% etanol for å sterilisere magen til den gravide kvinne. Løft hud og muskel av den nedre del av magen opp og bort fra de indre organer, og dissekere åpen i kvinn…

Representative Results

Ved hjelp av dette preparatet teknikken, var vi i stand til å oppdage fosforylert Smad 1,5,8 (pSmad) i enkle Aortaklaffefeil regioner fra E13.5 embryoer. Som vist i figur 1A, er tilstrekkelig til å detektere en svak pSmad bånd proteinet isolert fra en eneste ventil region. Signal intensitet øker proporsjonalt med antall ventil regioner som er gruppert. Viktigere, forblir pSmad / β-aktin ratio nesten konstant på tvers av de ulike utvalgsstørrelser (figur 1C). På grunn …

Discussion

Evnen til å kvantifisere protein nivåer i tidlig embryo mus og chick hjerteventil regioner gir et ekstra verktøy for å forstå de kritiske cellulære signal arrangementer for ventil utvikling. Vår protokoll beskrevet her skiller seg ikke mye fra standard protein isolasjonsprosedyrer. Men ved å endre noen viktige skritt, har vi lykkes fått fosforylerte proteiner fra ekstremt små utvalgsstørrelser. For å oppnå dette utfallet, kan fremgangsmåten er av særlig betydning. For å sikre at kvaliteten protein er erh…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Timed-pregnant mouse			To be dissected at the embryonic stage of interest
Stereoscopic microscope	Nikon	SMZ645
0.1 M Tris, pH 7.6
Microscissors	Fine Science Tools	15003-08
Fine forceps, #5	Fine Science Tools	11251-30
Dissecting needle holders	Ted Pella Inc.	13560
Dissecting needles	Ted Pella Inc.	13561-10
Micropipette, 20 μl, with tips
Lysis buffer			50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton
PhosSTOP	Roche	4906845001	Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer
TissueLyser LT	Qiagen	85600
Stainless steel beads	Qiagen	69989
Microcentrifuge