Eiwit Isolatie van het ontwikkelen van embryonale Mouse Heart Valve Gewest

Summary

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

Abstract

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 μg of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

Introduction

In staat zijn om eiwit expressie niveaus te identificeren en te kwantificeren is een standaard techniek voor dier-en cel-gebaseerde experimenten. Ondanks een langdurige interesse in vroege embryonale ontwikkeling hartklep, evalueren eiwitexpressie in dit specifieke weefsel tijdens ontwikkeling momenteel beperkt tot immunohistochemie in zowel het kuiken en muis ^1,2. Een deel van de moeilijkheid kwantificeren eiwitexpressie in de ontwikkeling kleppen meeste modelorganismen (bijvoorbeeld kuiken en muis) is de kleine omvang van de kleppen die de hoeveelheid eiwit die kan worden verkregen beperkt. Zo kwantitatieve analyses, onderzoekers normaliter afhankelijk RNA-extractie en amplificatie voor daaropvolgende kwantitatieve PCR of microarray-analyse ^2-5. Echter, RNA en eiwit expressie niveaus niet geheel correlatieve ^6, dus gericht op RNA expressie kan geen strenge wegens de vele veranderingen die optreden in een bepaalde signaleringroute op verschillende momenten tijdens de ontwikkeling. Op basis van deze grens in de momenteel beschikbare methoden het doel van deze procedure is een protocol voor het betrouwbaar om voldoende hoeveelheden eiwitten van de muis embryonale ontwikkeling hartklep gebieden voor kwantitatieve analyse van veranderingen die optreden in verschillende signalisatiewegen belang te ontwikkelen de rijping van dit weefsel.

Embryonale kleppen zijn reeds algemeen ontleed uit muizen voor RNA isolatie en vervolgens genexpressieanalyse ^2-5. Echter, deze studies beperkt tot het gebruik genexpressie als uitlezen van signaleringsroute activatie, waarbij de detectie van sporen posttranslationele eiwit modificaties die stroomafwaartse signalering beïnvloeden niet toestaat. De RNA-isolatietechnieken als uitgangspunt, begonnen we met het ontleden van de gebieden van belang. Omdat onze interesse was het opsporen van gefosforyleerd eiwitten die indicatief zijn voor het signaleren pat warenHWAY activiteit gedurende een bepaalde periode aortaklep ontwikkeling (E13.5-14.5), voerden we alle dissecties in fosfaatvrije Tris buffer en de kleppen in een Tris-gebaseerde lysis buffer met fosfatase en proteaseremmers verzameld. In het specifieke geval enkel de aortaklep gebieden werden opgevangen, maar de pulmonaalklep regio kan gemakkelijk worden verkregen op hetzelfde moment. De klep gebieden werden vervolgens gehomogeniseerd en gecombineerd met een monsterbuffer die momenteel wordt gebruikt voor eiwitexpressie bij volwassen hartkleppen ⁷ bestuderen. Via kleine monstervolumes (bijvoorbeeld 2 ui) en samenbrengen klepgebieden van embryo's met hetzelfde genotype, waren we in staat om gefosforyleerde en niet-gefosforyleerde eiwitten detecteren embryonale dag 13.5 ^8. Omdat de klep gebieden worden ingevroren en opgeslagen in lysis buffer, kan embryo genotyperen indien nodig voordat bundelen.

Deze techniek verbreedt de set van tools die beschikbaar zijn voor het evalueren van cel signaling wegen tijdens de ontwikkeling en biedt een kwantitatieve compliment voor immunohistochemie, in het bijzonder voor de ontwikkeling van hartkleppen. Deze techniek moet niet alleen nuttig om ontwikkelingsstoornissen cardiologen, maar ook voor alle ontwikkelings-biologen die werken met een vroeg stadium embryo's geïnteresseerd zijn in regio's die beperkte weefsel bevatten.

Protocol

OPMERKING: Alle experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Universiteit van North Carolina in Chapel Hill. 1 Accijnzen de aortaklep Met een goedgekeurde euthanasie techniek voor het embryonale stadium plaats, euthanize een zwangere muis met pups op de gewenste embryonale dag (E) van ontwikkeling. Gebruik van 70% ethanol aan de buik van de zwangere vrouw te steriliseren. Til de huid en spieren van de onderbuik omhoog en van …

Representative Results

Met behulp van deze voorbereiding techniek, waren we in staat om gefosforyleerd Smad- 1,5,8 (pSmad) op te sporen in enkele aortaklep regio van E13.5 embryo's. Zoals getoond in figuur 1A, het eiwit geïsoleerd uit zelfs een enkele klepgebied volstaat een zwakke band pSmad detecteren. Intensiteit van het signaal toeneemt evenredig met het aantal klepgebieden die worden samengevoegd. Belangrijk is dat de pSmad / β-actine-ratio blijft vrijwel constant over de verschillende steekproefomvang <…

Discussion

De mogelijkheid om eiwit niveaus hartklep regio's te kwantificeren in de vroege embryonale muis en kuiken biedt een extra instrument voor het begrijpen van de kritische cellulaire signalering evenementen voor klep ontwikkeling. Ons protocol hierin beschreven verschilt niet veel van de standaard eiwitisolatie procedures. Echter, door het wijzigen van een aantal belangrijke stappen, hebben we met succes gefosforyleerd eiwitten verkregen uit zeer kleine steekproeven. Om dit resultaat te bereiken, zijn de volgende stapp…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Timed-pregnant mouse			To be dissected at the embryonic stage of interest
Stereoscopic microscope	Nikon	SMZ645
0.1 M Tris, pH 7.6
Microscissors	Fine Science Tools	15003-08
Fine forceps, #5	Fine Science Tools	11251-30
Dissecting needle holders	Ted Pella Inc.	13560
Dissecting needles	Ted Pella Inc.	13561-10
Micropipette, 20 μl, with tips
Lysis buffer			50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton
PhosSTOP	Roche	4906845001	Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer
TissueLyser LT	Qiagen	85600
Stainless steel beads	Qiagen	69989
Microcentrifuge