The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.
Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 μg of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.
יכולת לזהות ולכמת רמות ביטוי חלבון היא טכניקה סטנדרטית לבהמה וניסויים מבוססי תאים. עם זאת, למרות ארוך שנתי עניין בפיתוח שסתום לב עוברי מוקדם, הערכת ביטוי חלבון ברקמה הספציפית הזה במהלך ההתפתחות כיום מוגבלת לאימונוהיסטוכימיה בשני האפרוח ו1,2 עכבר. חלק מהקושי של כימות ביטוי חלבון בשסתומי הפיתוח של רוב האורגניזמים מודל (למשל, אפרוח ועכבר) הוא בגודל הקטן של השסתומים, אשר מגביל את כמות החלבון שניתן להשיג. לפיכך, לניתוחים כמותיים, חוקרים בדרך כלל מסתמכים על מיצוי RNA והגברה לPCR כמו שלאחר מכן או ניתוח microarray 2-5. עם זאת, רמות ביטוי RNA והחלבון אינן מלא גומלות 6, כל כך מתמקדות בביטוי RNA אינו יכולות לספק חשבון קפדני של שינויים הרבים המתרחשים בכל איתות שניתנהמסלול בזמנים שונים במהלך התפתחות. בהתבסס על מגבלה זו במתודולוגיה זמינה כרגע, המטרה של הליך זה הייתה לפתח פרוטוקול למהימן קבלת כמות מספקת של חלבון מאזורי שסתום לב העכבר עוברי מתפתחים לניתוח כמותי של שינויים המתרחשים במסלולי איתות שונים שחשובים ב ההבשלה של רקמה זו.
שסתומים עובריים כבר הם גזורים בדרך כלל מעכברים לבידוד RNA וניתוח ביטוי גנים לאחר 2-5. עם זאת, מחקרים אלו היו מוגבלים לשימוש בביטוי גנים כקריאה מתוך איתות הפעלת מסלול, שאינו מאפשר זיהוי של לאתר שינויי חלבון לאחר translational שעשוי להשפיע על איתות במורד הזרם. תוך שימוש בטכניקות בידוד RNA כנקודת התחלה, התחלנו עם לנתח האזורים של עניין. בגלל האינטרס שלנו היה גילוי חלבוני phosphorylated שהיו מעיד על טפיחת איתותפעילות hway במהלך תקופה מסוימת של התפתחות שסתום אב העורקים (E13.5-14.5), ביצענו את כל הניתוחים במאגר טריס נטול פוספט ואספתי את השסתומים במאגר תמוגה מבוססת טריס עם מעכבי phosphatase ופרוטאז. במקרה הספציפי שלנו, רק אזורי שסתום אב העורקים נאספו, אבל יכול בקלות להיות מושגת אזור שסתום ריאתי באותו הזמן. אזורי שסתום היו אז הומוגני ושילוב עם מאגר מדגם המשמש כיום ללמוד ביטוי חלבון בשסתומי לב מבוגר 7. על ידי שימוש בכמויות קטנות מדגם (למשל, 2 μl) ואיגום אזורי שסתום מעוברים עם גנוטיפ זהה, שהיינו מסוגל לזהות חלבונים עוברים פוספורילציה וnonphosphorylated ביום עוברי 13.5 8. מאחר שניתן להקפיא את אזורי שסתום ומאוחסנים במאגר תמוגה, ניתן genotyped עוברים במידת צורך לפני איגום.
טכניקה זו מרחיבה את הסט של כלים הזמינים להערכת סיגנליזטורי תאמסלולים גרם במהלך פיתוח ומספק מחמאה כמותי לאימונוהיסטוכימיה, במיוחד עבור שסתומי לב מתפתחים. טכניקה זו צריכה להיות בעל ערך לא רק לקרדיולוגים התפתחותיים, אלא גם לכל הביולוגים התפתחותיים שעובדים עם עוברים בראשית התפתחות מעוניינים באזורים המכילים רקמה מוגבלת.
היכולת לכמת רמות חלבון בעכבר עוברי מוקדם וחומוס אזורי שסתום לב מספקת כלי נוסף להבנת אירועי איתות התאיות הקריטיים להתפתחות שסתום. הפרוטוקול שלנו שתואר במסמך זה אינו שונה בהרבה מהנהלים בידוד חלבון סטנדרטיים. עם זאת, על ידי שינוי כמה שלבים עיקריים, שהשגנו בהצלחה חלבוני…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Andrea Portbury and Davin Townley-Tilson for critical reading of the manuscript and the NIH (grant # R01HL061656) for funding support.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Timed-pregnant mouse | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
0.1 M Tris, pH 7.6 | |||
Microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
Fine forceps, #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
Dissecting needle holders | Ted Pella Inc. | 13560 | |
Dissecting needles | Ted Pella Inc. | 13561-10 | |
Micropipette, 20 μl, with tips | |||
Lysis buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton | ||
PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer |
TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | |
Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
Microcentrifuge |