Белок Выделение из развивающихся эмбриональных Mouse клапанов сердца регионе
Summary
The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.
Abstract
Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 μg of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.
Introduction
Будучи в состоянии идентифицировать и количественно уровни экспрессии белка является стандартным методом с помощью животных и экспериментов на основе клеток. Однако, несмотря на давний интерес в начале эмбрионального развития сердечного клапана, оценки экспрессии белка в данном конкретном ткани во время развития в настоящее время ограничивается иммуногистохимии как в кур и мыши 1,2. Часть трудностей в количественной оценки экспрессии белка в развивающихся клапанов большинстве модельных организмов (например, кур и мышей) является небольшой размер клапанов, что ограничивает количество белка, который может быть получен. Таким образом, для количественного анализа, исследователи, как правило, полагаются на экстракции РНК и амплификации для последующего количественного ПЦР или микрочипов анализа 2-5. Тем не менее, уровни экспрессии РНК и белка не полностью корреляционная 6, так упором на выражение РНК не может обеспечить строгий учет многочисленных изменений, которые происходят в той или иной сигнализациипуть в разное время разработок. На основании этого предела в имеющихся в настоящее время методологии, цель этой процедуры в том, чтобы разработать протокол для надежной получения достаточного количества белка из развивающихся эмбриональных мышиных регионах клапана сердца для количественного анализа изменений, происходящих в различных сигнальных путей, которые важны в созревание этой ткани.
Эмбриональные клапаны уже обычно вырезали у мышей для выделения РНК и последующее гена анализа экспрессии 2-5. Тем не менее, эти исследования были ограничены использованием генной экспрессии как считывания сигнализации активации пути, который не позволяет обнаруживать обнаружить посттрансляционные модификации белков, которые могут повлиять нижестоящую передачу сигналов. Используя методы выделения РНК в качестве отправной точки, мы начали с рассекает регионах, представляющих интерес. Потому что наш интерес был обнаружения фосфорилированные белки, которые свидетельствовали о сигнализации погладитьhway активности в течение определенного периода развития клапана аорты (E13.5-14.5), мы провели все вскрытия в фосфатном свободной Трис-буфера и собирали клапанов в Трис-буфере для лизиса, основанной с фосфатазы и ингибиторы протеазы. В нашем конкретном случае, только аорты области клапанов были собраны, но область легких клапана может быть легко получена в то же время. В области клапанов были затем гомогенизируют и в сочетании с буфера выборки, которые в настоящее время используются для изучения экспрессии белка у взрослых сердечных клапанов 7. Используя небольшие объемы проб (например, 2 мкл) и объединения клапанов регионы из эмбрионов с того же генотипа, мы смогли обнаружить фосфорилированные и nonphosphorylated белки в день эмбрионального 13,5 8. Поскольку регионы клапанов можно заморозить и хранить в буфере для лизиса, эмбрионы могут быть генотипированы при необходимости до объединения.
Эта техника расширяет набор инструментов, которые доступны для оценки клеток сигнализаторг путей во время развития и обеспечивает количественный комплимент иммуногистохимии, специально для развивающихся сердечных клапанов. Эта техника должна иметь выгоду не только к кардиологам развития, но и для всех биологов развития, которые работают с ранних эмбрионов на стадии заинтересованы в регионах, которые содержат ограниченный ткани.
Protocol
Representative Results
Discussion
Возможность количественно уровни белка в раннем эмбриональном мыши и цыпленок регионы клапана сердца обеспечивает дополнительный инструмент для понимания критических событий клеточные сигнальные для развития клапана. Наш протокол, описанный здесь, не сильно отличаются от стандарт?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Andrea Portbury and Davin Townley-Tilson for critical reading of the manuscript and the NIH (grant # R01HL061656) for funding support.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Timed-pregnant mouse | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| 0.1 M Tris, pH 7.6 | |||
| Microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Fine forceps, #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Dissecting needle holders | Ted Pella Inc. | 13560 | |
| Dissecting needles | Ted Pella Inc. | 13561-10 | |
| Micropipette, 20 μl, with tips | |||
| Lysis buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton | ||
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | Add 1 tablet to 10 ml lysis buffer |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | |
| Stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| Microcentrifuge |
Referências
- Wirrig, E. E., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Differential expression of cartilage and bone-related proteins in pediatric and adult diseased aortic valves. J Mol Cell Cardiol. 50, 561-569 (2011).
- Chakraborty, S., et al. Twist1 promotes heart valve cell proliferation and extracellular matrix gene expression during development in vivo and is expressed in human diseased aortic valves. Dev Biol. 347, 167-179 (2010).
- Lee, M. P., Yutzey, K. E. Twist1 directly regulates genes that promote cell proliferation and migration in developing heart valves. PLoS One. 6 (e29758), (2011).
- Peacock, J. D., Huk, D. J., Ediriweera, H. N., Lincoln, J. Sox9 transcriptionally represses Spp1 to prevent matrix mineralization in maturing heart valves and chondrocytes. PLoS One. 6 (e26769), (2011).
- Chakraborty, S., Cheek, J., Sakthivel, B., Aronow, B. J., Yutzey, K. E. Shared gene expression profiles in developing heart valves and osteoblast progenitor cells. Physiol Genomics. 35, 75-85 (2008).
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13, 227-232 (2012).
- Meng, X., et al. Expression of functional Toll-like receptors 2 and 4 in human aortic valve interstitial cells: potential roles in aortic valve inflammation and stenosis. Am J Physiol Cell Physiol. 294, 29-35 (2008).
- Dyer, L. A., Wu, Y., Moser, M., Patterson, C. BMPER-induced BMP signaling promotes coronary artery remodeling. Biologia do Desenvolvimento. 386, 385-394 (2014).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Garside, V. C., Chang, A. C., Karsan, A., Hoodless, P. A. Co-ordinating Notch, BMP, and TGF-beta signaling during heart valve development. Cell Mol Life Sci. 70, 2899-2917 (2013).
- Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. Fate of the mammalian cardiac neural. Development. 127, 1607-1616 (2000).
- Scherptong, R. W., et al. Morphogenesis of outflow tract rotation during cardiac development: the pulmonary push concept. Dev Dyn. 241, 1413-1422 (2012).
- Mohler, E. R., Adam 3rd, L. P., McClelland, P., Graham, L., Hathaway, D. R. Detection of osteopontin in calcified human aortic valves. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17, 547-552 (1997).
