La regeneración renal en adultos de pez cebra por gentamicina lesión inducida
Summary
Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.
Abstract
The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.
Introduction
El riñón es esencial para la homeostasis de fluidos, la regulación de la presión arterial y la filtración de los residuos del cuerpo. Aunque los mamíferos son capaces de reparar nefronas existentes después de la lesión utilizando células epiteliales diferenciadas 1-4, que parecen carecer de una piscina de células madre reservadas 5 y son incapaces de formar nuevas nefronas de novo. En contraste a los mamíferos, peces adultos son capaces de formar nuevas nefronas largo de la vida adulta para apoyar el crecimiento de los peces y en respuesta a la lesión 6,7. El pez cebra, Danio rerio, es un organismo modelo de gran valor para el estudio de la regeneración de órganos 8-10 y tiene el potencial para proporcionar información de gran alcance en las aplicaciones de la ingeniería de la reparación de los riñones humanos. La Tg (Lhx1a: EGFP) transgén 11 se ha demostrado para etiquetar un conjunto de células progenitoras nefrona en el riñón adultos de pez cebra 12, sin embargo los mecanismos que controlan la respuesta de lhx1a + células a una lesión rEmain claro.
La gentamicina es un antibiótico aminoglucósido ampliamente utilizado con efectos nefrotóxicos y ototóxicos conocidos en humanos 13. La inyección intraperitoneal de gentamicina es un método establecido de inducir lesión renal aguda en peces 6. Esta lesión en imita pescado la pérdida de epitelio tubular y la cicatrización de los glomérulos que se produce en los seres humanos después de la gentamicina sobredosis 14. La inducción de lesiones en el pez cebra por inyección de gentamicina es una manera conveniente de inducir una respuesta regeneración síncrono fuerte, con muchas nuevas nefronas producidos y de proceder simultáneamente a través de etapas de la formación, la proliferación y la diferenciación.
Este protocolo detalla nuestro método de lesión robusta y reproducible en el pez cebra riñón adulto mediante la utilización de un proceso de selección visual no invasiva para reducir al mínimo los valores atípicos. Aprovechamos el hecho de que las lesiones con gentamicina conduce a la muerte del tejido renal epitelial y formatoión de cilindros tubulares renales, que luego se acumulan en masas en los conductos mesonéfricos y cloaca. Estos son pasados por el pescado y se pueden observar visualmente en el agua. Esto nos permite a la pantalla para los peces con una fuerte lesión no letal, que luego pueden ser agrupados para su posterior experimentación. Reducir al mínimo el número de peces o no lesionado que mueren antes de llegar al punto final del experimento conduce a más uniforme y la recopilación de datos eficiente y análisis. Además, no se requieren dispositivos especiales o reactivos, por lo que este método rentable y adecuado para su uso en un entorno académico o la enseñanza. Usando este método, aquí mostramos las crecientes efectos de la dosis de gentamicina en la regeneración del riñón, así como el efecto del aumento de temperatura.
Protocol
Representative Results
Discussion
El pez cebra es ideal para el estudio de la regeneración de órganos adultos incluyendo el adulto riñón mesonéfrico 6. Estudios recientes han aprovechado de marcadores moleculares y nuevas líneas reportero transgénicos para caracterizar mejor los pasos que se dan durante la regeneración de nefronas y lo que las células podrían ser responsables 7,12. Observación de desechos urinarios se ha utilizado durante más de un siglo para diagnosticar la enfermedad renal en humanos 16. Aq…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant F32DK091998 to CNK; NIH grant RO1DK041071 and Harvard Stem Cell Institute grant D001229 to IAD. The authors thank Neil Hukriede for the lhx1ain situ probe.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| gentamicin sodium sulfate | Sigma | G1264 | TOXIC, purity varies from batch to batch |
| plastic transfer pipets | Fisher | 13-711-7M | |
| 1 ml Norm-Ject syringes | Electron Microscopy Sciences | 72520 | green plastic syringes, ordinary 1ml syringes are OK, but harder to read accurately |
| 30G1/2 needles | Becton Dickinson | 305106 | |
| ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine) | Sigma | A5040 | IRRITANT |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make 4% in 1xPBS for working solution |
Referências
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