Ein Verfahren zur Mikroinjektion von<em> Patiria Minata</em> Zygotes
Summary
Methoden, die morphanten Embryonen sind unerlässlich, um Entwicklungsmechanismen und Gen-regulatorische Netzwerke zu studieren. Das Sea Star Patiria miniata ist ein aufstrebendes Modellsystem für diese Studien. Hier präsentieren wir ein Protokoll für den Erhalt von Gameten erzeugende Kulturen von Embryonen und schnelle Mikroinjektion von Zygoten von dieser Spezies.
Abstract
Stachelhäuter haben lange für die Untersuchung von Gen-Regulation und Evolution von Entwicklungsprozessen ein beliebtes Modellsystem für die Untersuchung der Fortpflanzung und Entwicklung, und in jüngerer Zeit. Das Sea Star, Patiria miniata, gewinnt Prävalenz als Modellsystem für diese Art von Studien, die bisher fast ausschließlich in den Seeigel, Strongylocentrotus purpuratus und Lytechinus variegatus durchgeführt wurden. Ein Vorteil dieser Modellsysteme ist die Leichtigkeit der Herstellung von modifizierten Embryonen, bei denen ein bestimmtes Gen ist nach oben oder unten reguliert, Markierung einer Gruppe von Zellen, oder Einführen eines Reportergens. Eine einzelne Mikroinjektionsverfahren ist in der Lage eine Vielzahl von solchen modifizierten Embryonen. Hier stellen wir ein Verfahren zur Gewinnung von Gameten aus P. miniata, Herstellung Zygoten, und die Einführung von störenden Reagenzien über die Mikroinjektion. Gesunde morphanten Embryonen werden anschließend für die quantitative und qualitative Studien von GE isoliertne Funktion. Die Verfügbarkeit von Genom und Transkriptom Daten für diesen Organismus die Arten von Untersuchungen, die durchgeführt werden und die Leichtigkeit der Ausführung von ihnen erhöht.
Introduction
Das Sea Star, Patiria miniata, (allgemein als die Fledermaus Stern) ist als eine interessante und vielseitige Modellsystem Schwellen für eine Vielzahl von Mobil 1-3, Entwicklungs 4,5, Evolutions 6 bis 8 und 9 bis 11 ökologische Studien. Erwachsene P. miniata entlang der Pazifikküste von Sitka, Alaska nach Baja, Kalifornien 12 verteilt sind und leicht in Meerwasseraquarien gehalten. Eizellen sind erhältlich jährig und jedes Weibchen kann Zehntausende von Eiern zu vergießen. Eizellen sind leicht gereift und außen 13 befruchtet. Die daraus resultierenden Embryonen sind durchsichtig erlaubt eine einfache Beobachtung; entwickeln sie synchron und erfordern nur Meerwasser für die Entwicklung. Gesamte Genom Montage und mehrere Transkriptomen sind auch für P. verfügbar miniata ( Echinobase.org ). Solche Vorteile machen sie ideal für eine Reihe von Forschungsund Lehrzwecke.
In den letzten Jahren P. miniata hat sich zu einem Modellsystem für die Entwicklungs genregulatorischen Netzwerkanalysen 14-16. Ziel solcher Untersuchungen ist die gesamte Komplement regulatorischen Gene zu identifizieren und zu bestimmen, die das Netz ihre Wechselwirkungen. Ein großer Teil dieser Arbeit bringt störenden Genexpression durch Einführung von Antisense-Oligonukleotide oder in vitro synthetisierten mRNA. Zusätzlich sind cis-regulatorischen Analysen verwendet werden, um die Funktion von regulatorischen DNA 15 charakterisieren. Diese Analysen erfordern Einführung Störungs Reagenzien und / oder DNA-Reporterkonstrukte in Embryonen. Ferner sind die nachgeschalteten Effekte dieser Störungen zu charakterisieren, muß man viele Embryonen zu Veränderungen in der Genexpression potentieller Ziele zu untersuchen. Verfahren zur Mikroinjektion von vielen Hunderten von Zygoten sind von zentraler Bedeutung für diese Arbeit.
Stachelhäuter, darunter P. miniata </em>, erfordern viele Monate bis zur Geschlechtsreife zu erreichen. Aus diesem Grund ist es im allgemeinen nicht praktisch, zu entwickeln und aufrechtzuerhalten transgenen Linien dieser Tiere für Experimente. Daher kann die Zucht von transgenen Erwachsene nicht effizient geändert Embryonen erstellen. Stattdessen müssen Störung auftreten, de novo durch Mikroinjektion. Mikroinjektion bietet die Möglichkeit, Embryonen mit Reagenzien, die nicht zellgängig sind zu ändern. Das folgende Protokoll beschreibt ein Verfahren, um DNA, mRNA, Zell Tracer und Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden in Hunderten von befruchteten Eiern in einer 2-3 h durch Mikroinjektion sitzt einzuführen. Dies erzeugt genügend Material für eine Vielzahl von stromabwärts Experimente, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, qPCR beschränkt, in-situ-Hybridisierung, RNA-Seq und Western Blotting.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt zwei wichtige Schritte, die schwierig für unerfahrene Anwender dieser Technik sind aber unerlässlich für die erfolgreiche Schaffung morphanten Embryonen. Die erste ist die Auswahl gesunder Eizellen, die reifen und richtig düngen wird. Der Prozentsatz der normalen Entwicklung in einer Kultur hängt von der Jahreszeit, der Gesundheit des Tieres, und die Anzahl der Male, die Oozyten wurden aus einem einzigen Individuum geerntet. Eizellen sind in der Regel von besserer Qualität von April bis Oktober. Es ist wic…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation und IOS IOS 0844948 1024811 unterstützt
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1-Methyladenine | Acros Organics (Fisher Scientific) | AC20131-1000 | |
| 190 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0185-C/5PK-05 | |
| 100 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0105-C/5PK-05 | |
| Polystyrene Petri Dishes, 60mm x 15mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Capillary tubing | FHC, Inc | 30-30-0 | For pulling microinjection needles |
| Model P-97 Needle Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Dextran, Rhodamine Green | Life Technologies | D7163 | If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer |
| Instant Ocean Sea Salt | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Also available in many pet stores |
| Microloader Tips | Eppendorf | 5242 956.003 |
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