En metod för mikroinjektion av<em> Patiria minata</em> Zygoter
Summary
Metoder som producerar morphant embryon är viktigt att studera utvecklingsmekanismer och genreglerande nätverk. Havet stjärnan Patiria miniata är en framväxande modellsystem för dessa studier. Här presenterar vi ett protokoll för att erhålla könsceller, som producerar kulturer av embryon, och snabb mikroinjektion av zygoter från denna art.
Abstract
Tagghudingar har länge varit en favorit modellsystem för studier av reproduktion och utveckling, och på senare tid för att studera genreglering och utvecklingen av utvecklingsprocesser. Havet stjärna, Patiria miniata, vinner utbredning som modellsystem för dessa typer av studier som tidigare utförts nästan uteslutande i de sjöborrar, Strongylocentrotus purpuratus och Lytechinus variegatus. En fördel med dessa modellsystem är den lätthet att producera modifierade embryon i vilka en särskild gen är upp eller nedregleras, märkning av en grupp av celler, eller införa en reportergen. En enda mikroinjektion metod kan skapa en mängd olika sådana modifierade embryon. Här presenterar vi en metod för att erhålla könsceller från P. miniata, producerar zygotes, och införa störande reagens via mikroinjektion. Friska morphant embryon därefter isoleras för kvantitativa och kvalitativa studier av GEne funktion. Tillgången på genom och transkriptom data för denna organism har ökat de typer av undersökningar som utförs och hur lätt uppdragen.
Introduction
Havet stjärna, Patiria miniata, (vanligen kallad bat stjärnan) växer fram som ett intressant och mångsidigt modellsystem för en mängd olika cell 1 3, utvecklings 4,5, evolutionära 6 8 och ekologiska studier 9- 11. Vuxen P. miniata är fördelade längs Stillahavskusten från Sitka, Alaska till Baja, Kalifornien 12 och lätt underhålls i marina akvarier. Oocyter kan erhållas året runt och varje hona kan kasta tiotusentals ägg. Oocyter lätt mognat och gödslas externt 13. De resulterande embryon är transparenta vilket möjliggör enkel observation; de utvecklas synkront, och kräver endast havsvatten för utveckling. Hela genomet montering och flera transcriptomes är också tillgängliga för P. miniata ( Echinobase.org ). Sådana fördelar gör dem idealiska för en rad forskningsoch undervisningsändamål.
Under de senaste åren, P. miniata har blivit ett modellsystem för utvecklings genreglerande nätanalyser 14- 16. Syftet med sådana undersökningar är att identifiera hela komplimang av reglerande gener och bestämma nätverket av deras interaktioner. Mycket av detta arbete medför störande genuttryck genom införande av antisensoligonukleotider eller in vitro syntetiserade mRNA. Dessutom är cis-regulatoriska analyser användes för att karakterisera funktionen av reglerande DNA 15. Dessa analyser kräver introduktion av störnings reagens och / eller DNA-reporterkonstruktioner i embryon. Vidare att karaktärisera de efterföljande effekterna av dessa störningar måste man analysera många embryon till förändringar i genuttryck av potentiella mål. Tekniker för mikroinjektion av många hundra zygoter är centrala för detta arbete.
Tagghudingar, däribland P. miniata </em>, kräva många månader att bli könsmogna. På grund av detta är det i allmänhet inte praktiskt att utveckla och upprätthålla transgena linjer av dessa djur för försöksverksamhet. Därför uppfödning av transgena vuxna kan inte på ett effektivt sätt skapa modifierade embryon. I stället måste störning uppstår de novo genom mikroinjektion. Mikroinjektion erbjuder en möjlighet att modifiera embryon med reagenser som inte cellpermeabel. Följande protokoll beskriver en metod för att införa DNA, mRNA, cellspårämnen, och morfolino antisensoligonukleotider i hundratals befruktade ägg i en 2-3 tim sammanträdet genom mikroinjektion. Detta producerar tillräckligt material för en mängd olika experiment nedströms inklusive, men inte begränsat till, qPCR, in situ hybridisering, RNA-Seq, och western blotting.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns två viktiga steg som är svåra för nybörjare av denna teknik, men är väsentliga för framgångsrikt skapa morphant embryon. Den första är att välja hälsosamma oocyter som förfaller och befrukta ordentligt. Andelen normal utveckling i en kultur beror på säsong, hälsa djuret, och antalet gånger som äggceller har skördats från en enda individ. Oocyter tenderar att vara av bättre kvalitet från april till oktober. Det är viktigt att titta noga på ägg innan du fortsätter att se till att de fl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Science Foundation IOS 0844948 och IOS 1024811
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1-Methyladenine | Acros Organics (Fisher Scientific) | AC20131-1000 | |
| 190 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0185-C/5PK-05 | |
| 100 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0105-C/5PK-05 | |
| Polystyrene Petri Dishes, 60mm x 15mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Capillary tubing | FHC, Inc | 30-30-0 | For pulling microinjection needles |
| Model P-97 Needle Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Dextran, Rhodamine Green | Life Technologies | D7163 | If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer |
| Instant Ocean Sea Salt | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Also available in many pet stores |
| Microloader Tips | Eppendorf | 5242 956.003 |
Referências
- Terasaki, M. Quantification of fluorescence in thick specimens, with an application to cyclin B-GFP expression in starfish oocytes. Biol. Cell Auspices Eur. Cell Biol. Organ. 98, 245-252 (2006).
- Terasaki, M., Runft, L. Two-stage dependence for 1-methyladenine induced reinitiation of meiotic maturation in starfish oocytes. Exp. Cell Res. 316, 2654-2663 (2010).
- O’Neill, F. J., Gillett, J., Foltz, K. R. Distinct roles for multiple Src family kinases at fertilization. J. Cell Sci. 117, 6227-6238 (2004).
- McCauley, B. S., Akyar, E., Filliger, L., Hinman, V. F. Expression of wnt and frizzled genes during early sea star development. Gene Expr. Patterns GEP. 13, 437-444 (2013).
- Yankura, K. A., Koechlein, C. S., Cryan, A. F., Cheatle, A., Hinman, V. F. Gene regulatory network for neurogenesis in a sea star embryo connects broad neural specification and localized patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 8591-8596 (2013).
- McCauley, B. S., Wright, E. P., Exner, C., Kitazawa, C., Hinman, V. F. Development of an embryonic skeletogenic mesenchyme lineage in a sea cucumber reveals the trajectory of change for the evolution of novel structures in echinoderms. EvoDevo. 3, 17 (2012).
- Annunziata, R., Martinez, P., Arnone, M. I. Intact cluster and chordate-like expression of ParaHox genes in a sea star. BMC Biol. 11, 68 (2013).
- Morino, Y., et al. Heterochronic activation of VEGF signaling and the evolution of the skeleton in echinoderm pluteus larvae. Evol. Dev. 14, 428-436 (2012).
- Hart, M. W. Structure and evolution of the sea star egg receptor for sperm bindin. Mol. Ecol. 22, 2143-2156 (2013).
- McGovern, T. M., Keever, C. C., Saski, C. A., Hart, M. W., Marko, P. B. Divergence genetics analysis reveals historical population genetic processes leading to contrasting phylogeographic patterns in co-distributed species. Mol. Ecol. 19, 5043-5060 (2010).
- Keever, C. C., et al. Discordant distribution of populations and genetic variation in a sea star with high dispersal potential. Evol. Int. J. Org. Evol. 63, 3214-3227 (2009).
- Lambert, P. . Sea Stars of British Columbia, Southeast Alaska, and Puget Sound. , (2000).
- Dorée, M., Guerrier, P., Leonard, N. J. Hormonal control of meiosis: specificity of the 1-methyladenine receptors in starfish oocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1669-1673 (1976).
- Hinman, V. F., Nguyen, A. T., Cameron, R. A., Davidson, E. H. Developmental gene regulatory network architecture across 500 million years of echinoderm evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 13356-13361 (2003).
- Hinman, V. F., Nguyen, A., Davidson, E. H. Caught in the evolutionary act: precise cis-regulatory basis of difference in the organization of gene networks of sea stars and sea urchins. Dev. Biol. 312, 584-595 (2007).
- McCauley, B. S., Weideman, E. P., Hinman, V. F. A conserved gene regulatory network subcircuit drives different developmental fates in the vegetal pole of highly divergent echinoderm embryos. Dev. Biol. 340, 200-208 (2010).
- Wessel, G. M., Voronina, E., Brooks, J. M. Obtaining and handling echinoderm oocytes. Methods Cell Biol. 74, 87-114 (2004).
- Sweet, H., et al. Blastomere isolation and transplantation. Methods Cell Biol. 74, 243-271 (2004).
- Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. Rapid microinjection of fertilized eggs. Methods Cell Biol. 74, 287-310 (2004).
- Core, A. B., Reyna, A. E., Conaway, E. A., Bradham, C. A. Pantropic retroviruses as a transduction tool for sea urchin embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 5334-5339 (2012).
