Um Método para microinjeção de<em> Patiria minata</em> zigotos
Summary
Métodos que produzem embriões morphant são essenciais para estudar mecanismos de desenvolvimento e redes de regulação gênicas. A estrela do mar Patiria miniata é um sistema modelo emergente para estes estudos. Aqui apresentamos um protocolo para a obtenção de gametas, produzindo culturas de embriões, e microinjeção rápida de zigotos de esta espécie.
Abstract
Equinodermos têm sido um sistema modelo favorito para estudos de reprodução e desenvolvimento, e, mais recentemente, para o estudo da regulação de genes e evolução dos processos de desenvolvimento. A estrela de mar, Patiria miniata, está ganhando prevalência como um sistema modelo para estes tipos de estudos que foram anteriormente realizadas quase que exclusivamente nos ouriços do mar, Strongylocentrotus purpuratus e Lytechinus variegatus. Uma vantagem destes sistemas modelo é a facilidade de produção de embriões modificados em que um gene particular é para cima ou reprimidos, rotular um grupo de células, ou a introdução de um gene repórter. Um método de microinjecção único é capaz de criar uma grande variedade de tais embriões modificados. Aqui, apresentamos um método para a obtenção de gametas a partir de P. miniata, produzindo zigotos, e introdução de reagentes perturbadores via microinjeção. Embriões morphant saudáveis são posteriormente isolado para estudos quantitativos e qualitativos da gefunção ne. A disponibilidade de dados do genoma e transcriptoma para este organismo aumentou os tipos de estudos que são realizados e da facilidade de executá-los.
Introduction
A estrela de mar, Patiria miniata, (vulgarmente conhecida como a estrela bat) está emergindo como um sistema modelo interessante e versátil para uma variedade de celular 1 a 3, de desenvolvimento 4,5, evolutiva 6 a 8, e estudos ecológicos 9 a 11. Adulto P. miniata são distribuídos ao longo da costa do Pacífico a partir de Sitka, no Alasca a Baja, Califórnia 12 e são facilmente mantidos em aquários marinhos. Os oócitos são obtidos durante todo o ano e cada fêmea pode lançar dezenas de milhares de ovos. Os oócitos são facilmente maturados e fertilizados externamente 13. Os embriões resultantes são transparentes permitindo a fácil observação; elas se desenvolvem de forma síncrona, e requerem apenas água do mar para o desenvolvimento. Montagem do genoma inteiro e vários transcriptomas também estão disponíveis para P. miniata ( Echinobase.org ). Essas vantagens tornam ideais para uma série de pesquisase fins de ensino.
Nos últimos anos, P. miniata tornou-se um sistema modelo para rede de regulação genética do desenvolvimento analisa 14 a 16. O objetivo desses estudos é identificar todo o elogio de genes regulatórios e determinar a rede de suas interações. Grande parte deste trabalho envolve a expressão do gene perturbadora através da introdução de oligonucleotídeos antisense ou in vitro sintetizado mRNAs. Além disso, análises de regulação em cis são utilizadas para caracterizar a função de DNA regulador 15. Estas análises requerem introdução de reagentes de perturbação e / ou repórter DNA constrói em embriões. Além disso, para caracterizar os efeitos a jusante dessas perturbações, deve-se testar muitos embriões para alterações na expressão de genes de alvos potenciais. Técnicas de microinjeção de muitas centenas de zigotos são fundamentais para este trabalho.
Equinodermes, incluindo P. miniata </em>, exigem muitos meses para atingir a maturidade sexual. Devido a isto, não é geralmente prático para desenvolver e manter linhas transgénicas destes animais de experimentação. Portanto, a criação de adultos transgênicos não pode de forma eficiente criar embriões modificados. Em vez disso, perturbação deve ocorrer de novo através de microinjecção. Microinjecção oferece uma oportunidade para modificar os embriões com os reagentes que não são de células-permeável. O protocolo seguinte descreve um método para introduzir ADN, ARNm, marcadores de células, e os oligonucleótidos anti-sentido morfolino em centenas de ovos fertilizados num 2-3 hr sessão através de microinjecção. Isto produz material suficiente para uma variedade de experiências, incluindo a jusante, mas não se limitando a, qPCR, hibridação in situ, o RNA-Seq, e transferência de western.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existem dois passos críticos que são difíceis para os usuários novatos desta técnica, mas são essenciais para a criação de embriões com sucesso morphant. A primeira é selecionar ovócitos saudáveis que vencem e fertilizar adequadamente. A percentagem de desenvolvimento normal em cultura depende da época do ano, a saúde do animal, e o número de vezes que os oócitos foram colhidas a partir de um único indivíduo. Oócitos tendem a ser de melhor qualidade a partir de abril a outubro. É importante olh…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation IOS e IOS 0844948 1024811
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1-Methyladenine | Acros Organics (Fisher Scientific) | AC20131-1000 | |
| 190 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0185-C/5PK-05 | |
| 100 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0105-C/5PK-05 | |
| Polystyrene Petri Dishes, 60mm x 15mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Capillary tubing | FHC, Inc | 30-30-0 | For pulling microinjection needles |
| Model P-97 Needle Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Dextran, Rhodamine Green | Life Technologies | D7163 | If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer |
| Instant Ocean Sea Salt | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Also available in many pet stores |
| Microloader Tips | Eppendorf | 5242 956.003 |
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