Une méthode pour micro-injection de<em> Patiria minata</em> zygotes
Summary
Méthodes qui produisent des embryons morphant sont indispensables pour étudier les mécanismes de développement et les réseaux de régulation génétique. L'étoile de mer Patiria miniata est un système de modèle émergent de ces études. Nous présentons ici un protocole pour obtenir des gamètes, la production de cultures d'embryons, et la micro-injection rapide de zygotes de cette espèce.
Abstract
Échinodermes ont longtemps été un système de modèle de prédilection pour les études de reproduction et le développement, et plus récemment pour l'étude de la régulation des gènes et de l'évolution des processus de développement. L'étoile de mer, Patiria miniata, gagne prévalence comme un système modèle pour ces types d'études qui ont déjà été effectuées presque exclusivement dans les oursins, Strongylocentrotus purpuratus et Lytechinus variegatus. Un avantage de ces systèmes de modèles est la facilité de produire des embryons modifiés dans laquelle un gène donné est vers le haut ou régulée à la baisse, le marquage d'un groupe de cellules, ou l'introduction d'un gène rapporteur. Procédé de micro-injection unique est capable de créer une grande variété de ces embryons modifiés. Ici, nous présentons une méthode pour obtenir des gamètes à partir de P. miniata, la production de zygotes, et l'introduction de réactifs perturbateurs par micro-injection. Embryons sains morphant sont ensuite isolés pour des études quantitatives et qualitatives de gefonction ne. La disponibilité de données sur le génome et du transcriptome pour cet organisme a augmenté les types d'études qui sont effectuées et la facilité de leur exécution.
Introduction
L'étoile de mer, Patiria miniata, (communément appelé l'étoile de chauve-souris) est en train de devenir un système de modèle intéressant et polyvalent pour une variété de cellules 1 à 3, de développement de 4,5, l'évolution de 6 à 8, et des études écologiques 9- 11. Adulte P. miniata sont répartis le long de la côte pacifique de Sitka, en Alaska à Baja, en Californie et 12 sont facilement maintenu dans les aquariums marins. Les ovocytes sont ronds obtenus l'année et chaque femelle peut perdre des dizaines de milliers d'œufs. Les ovocytes sont facilement maturation et fécondés à l'extérieur 13. Les embryons obtenus sont transparents permettant une observation facile; ils se développent de façon synchrone, et n'ont besoin que d'eau de mer pour le développement. Assemblage du génome entier et plusieurs transcriptomes sont également disponibles pour P. miniata ( Echinobase.org ). Ces avantages font la solution idéale pour un éventail de rechercheset à des fins d'enseignement.
Au cours des dernières années, P. miniata est devenu un système de modèle pour le réseau de régulation de gènes du développement des analyses du 14 au 16. Le but de ces études est d'identifier l'ensemble compliment de gènes régulateurs et de déterminer le réseau de leurs interactions. Une grande partie de ce travail implique l'expression des gènes perturbation par l'introduction d'oligonucléotides antisens ou pt ARNm synthétisé in vitro. En outre, les analyses réglementaires cis sont utilisés pour caractériser la fonction de l'ADN réglementaire 15. Ces analyses nécessitent l'introduction de réactifs de perturbation et / ou de l'ADN reporter construit dans des embryons. En outre, afin de caractériser les effets en aval de ces perturbations, il faut doser de nombreux embryons pour les changements dans l'expression du gène de cibles potentielles. Les techniques de micro-injection de plusieurs centaines de zygotes sont au centre de ce travail.
Échinodermes, y compris P. miniata </em>, nécessitent plusieurs mois pour atteindre la maturité sexuelle. De ce fait, il n'est généralement pas pratique pour développer et maintenir des lignées transgéniques de ces animaux d'expérimentation. Par conséquent, la reproduction des adultes transgéniques ne peut pas efficacement créer des embryons modifiés. Au lieu de cela, la perturbation doit se produire de novo à travers la micro-injection. Microinjection offre la possibilité de modifier les embryons avec des réactifs qui ne sont pas des cellules perméables. Le protocole suivant décrit un procédé pour introduire de l'ADN, de l'ARNm, des traceurs de cellules, et des oligonucleotides morpholino antisens dans des centaines d'oeufs fécondés dans une séance 2-3 h à travers la micro-injection. Ce produit suffisamment de matériau pour une série d'expériences en aval, y compris, mais sans s'y limiter, qPCR, hybridation in situ, l'ARN-Seq, et un transfert de Western en.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il ya deux étapes essentielles qui sont difficiles pour les utilisateurs novices de cette technique mais qui sont essentielles pour réussir à créer des embryons morphant. Le premier est la sélection des ovocytes sains qui viendront à échéance et fertiliser correctement. Le pourcentage d'évolution normale dans une culture dépend de la saison, de la santé de l'animal, et le nombre de fois que les ovocytes ont été récoltées à partir d'un seul individu. Les ovocytes ont tendance à être de meill…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par la National Science Foundation IOS 0844948 et 1024811 IOS
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1-Methyladenine | Acros Organics (Fisher Scientific) | AC20131-1000 | |
| 190 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0185-C/5PK-05 | |
| 100 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0105-C/5PK-05 | |
| Polystyrene Petri Dishes, 60mm x 15mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Capillary tubing | FHC, Inc | 30-30-0 | For pulling microinjection needles |
| Model P-97 Needle Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Dextran, Rhodamine Green | Life Technologies | D7163 | If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer |
| Instant Ocean Sea Salt | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Also available in many pet stores |
| Microloader Tips | Eppendorf | 5242 956.003 |
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