Method Article

A alta Ensaio imagem Conteúdo de Identificação da neurotoxina botulínica Inibidores

DOI:

10.3791/51915

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November 14th, 2014

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1Perkin Elmer Inc., 2Henry M. Jackson Foundation, 3The Geneva Foundation, 4ORISE, 5Frederick National Laboratory for Cancer Research, 6Division of Molecular and Translational Sciences, US Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 7DoD Biotechnology High Performance Computing Software Applications Institute (BHSAI), Telemedicine and Advanced Technology Research Center (TATRC), US Army Medical Research and Materiel Command (USAMRMC)

In This Article

Summary

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A neurotoxina botulínica é uma das toxinas mais potentes entre os agentes de risco biológico da Categoria A, mas uma terapêutica pós-exposição não está disponível. A abordagem de imagem de alto conteúdo é uma metodologia poderosa para identificar novos inibidores, pois permite a triagem multiparamétrica usando neurônios motores biologicamente relevantes, o principal alvo dessa toxina.

Abstract

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A proteína 25 associada a sinaptossomos (SNAP-25) é um componente do complexo do receptor de proteína de ligação NSF solúvel (SNARE) que é essencial para a liberação de neurotransmissores sinápticos. A neurotoxina botulínica sorotipo A (BoNT/A) é uma metaloprotease de zinco que bloqueia a exocitose do neurotransmissor clivando o componente SNAP-25 do complexo SNARE. Atualmente, não há medicamentos licenciados para tratar o envenenamento por BoNT/A após a internalização da toxina pelos neurônios motores. O desenvolvimento de medidas terapêuticas eficazes para combater a intoxicação por BoNT / A tem sido limitado, em parte devido à falta de ensaios robustos de alto rendimento para triagem de bibliotecas de pequenas moléculas. Aqui descrevemos um ensaio de imagem de alto conteúdo (HCI) com utilidade para identificação de inibidores de BoNT / A. Os esforços iniciais de otimização se concentraram em melhorar a reprodutibilidade dos resultados entre placas em vários experimentos independentes. Verificou-se que a automação da imunocoloração, aquisição e análise de imagens aumenta a consistência do ensaio e minimiza a variabilidade, permitindo a avaliação multiparâmetro de compostos experimentais em um sistema de neurônio motor murino.

Introduction

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A bactéria Clostridium botulinum produz neurotoxina botulínica, um dos mais potentes toxinas biológicas conhecidas para o homem 1. Existem 7 sorotipos BoNT distintas (TB / AG). BoNT / A-Gall induzir paralisia na junção neuromuscular, devido à proteólise complexo SNARE 2,3. SNARE proteólise impede-neurotransmissor vesícula de membrana de fusão e, por conseguinte, bloqueia a exocitose do neurotransmissor 4. O alvo SNARE específica depende do serotipo particular, BoNT envolvidos no processo de intoxicação. BoNT / A e BoNT / E se apegam SNAP-25 enquanto que cliva BoNT / C ambos SNAP-25 e syntaxin 5. O restantes serotip....

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Protocol

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Placa de 20.000 células ES de ratinho diferenciadas (MES) / poço em placas de 96 lisina revestidos assim Poli-D e manter no neurónio motor meios de diferenciação terminal por 5-7 dias.

Administração 1. Composto e Intoxicação com BoNT / A

Realizar todos os seguintes trabalhos em um gabinete BSL2 para manter a conformidade com as diretrizes do CDC / NIH.

  1. Preparar soluções de estoque 10 mM de cada composto da biblioteca em 100% de DMSO em placas de 96 poços de polipropileno. Usar o estoque 10 mM para preparar uma placa de diluição intermédia que é 10 vezes maior do que a concentração de triagem desejad....

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Results

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Os dados dos controlos altos e baixos criadas duas populações distintas com a diferença de duas medianas superiores a 3 desvios padrão (Figura 7A). O objectivo do processo de triagem é para encontrar os compostos dentro da população da amostra com valores próximos das populações de controlo positivo, assumindo uma distribuição normal dentro da população da amostra (Figura 7B, (i)). Os pontos de dados que são três desvios padrão além da média são considerados estatisticamente diferente d.......

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Discussion

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A alta potência de neurotoxinas botulínicas e relativa facilidade de seu armamento resultou em sua classificação como Categoria A (prioridade mais alta) agentes biothreat pelos Centros dos EUA para Controle e Prevenção de Doenças. Infelizmente, não há terapias aprovadas pela FDA para contrariar BoNT intoxicação após a toxina tenha sido internalizados pelos neurónios motores. Qualquer mecanismo druggable que promove a recuperação neuronal de BoNT intoxicação pode levar para o desenvolvimento de uma terapia potencial para.......

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Disclosures

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Krishna P Kota é funcionário da Perkin Elmer Inc. Waltham, MA, que produz instrumentos e software usados neste manuscrito. O conteúdo desta publicação não reflete necessariamente as opiniões ou políticas do Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, do Departamento de Defesa dos EUA, do Departamento do Exército dos EUA ou das instituições e empresas afiliadas aos autores.

Acknowledgements

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O financiamento foi fornecido pelo Joint Science and Technology Office – Chemical Biological Defense (JSTO-CBD), Defense Threat Reduction Agency (DTRA) sob o número do projeto patrocinador CCAR# CB3675 e National Institutes of Health (1 R21 AI101387-01 e 5 U01AI082051-05).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Neurotoxina botulínica A MetabiologicsNASem número de catálogo
Placas de microtitulaçãoGreiner 655946Placas de Poli-D-Lisina 96-poços
BACs anticorpoLampire BiologicalNA
MicrochemNational 0255
MetanolThermo ScientificA412-20
FormaldeídoThermo Scientific28908
Soro de cavaloInvitrogen16050
PE JANUS MDT Mini Estação de Trabalho AutomatizadaPerkin ElmerAJMDT01
OperaPerkin ElmerOP-QEHS-01
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1
BIII anticorpo de tubulinaR& D SystemsBAM1195
Tween 20SigmaP1379-1L
Hoechst 33342dye Invitrogen3570
Anti-mouse IgGInvitrogenA21236
Anti coelho IgGInvitrogenA10042
Columbus Software de análise de imagemPerkin ElmerVer 2.4
SpotfirePerkin ElmerVer 5.5
Alvejante CloroxFisher Scientific18-861-284
Pilha de
placas

References

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  1. Lamanna, C. The most poisonous poison. Science. 130, 763-772 (1959).
  2. Dover, N., Barash, J. R., Hill, K. K., Xie, G., Arnon, S. S. Molecular Characterization of a Novel Botulinum Neurotoxin Type H Gene. J. Infect. Dis. , (2013).
  3. Hakami, R. M., Ruthel, G., Stahl, A. M., Bavari, S.

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Botulinum Neurotoxin InhibitorsHigh Content ImagingSNAP 25 CleavageMouse Motor NeuronsImmunostaining AutomationImage Analysis SoftwarePhenotypic Screening AssayNeurotransmitter ReleaseToxin Uptake PreventionMetalloprotease Activity

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