बोटुलिनम Neurotoxin inhibitors के पहचान के लिए एक उच्च सामग्री इमेजिंग परख
Summary
Botulinum neurotoxin is one of the most potent toxins among Category-A biothreat agents, yet a post-exposure therapeutic is not available. The high content imaging approach is a powerful methodology for identifying novel inhibitors as it enables multiparameter screening using biologically relevant motor neurons, the primary target of this toxin.
Abstract
Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic neurotransmitter release. Botulinum neurotoxin serotype A (BoNT/A) is a zinc metalloprotease that blocks exocytosis of neurotransmitter by cleaving the SNAP-25 component of the SNARE complex. Currently there are no licensed medicines to treat BoNT/A poisoning after internalization of the toxin by motor neurons. The development of effective therapeutic measures to counter BoNT/A intoxication has been limited, due in part to the lack of robust high-throughput assays for screening small molecule libraries. Here we describe a high content imaging (HCI) assay with utility for identification of BoNT/A inhibitors. Initial optimization efforts focused on improving the reproducibility of inter-plate results across multiple, independent experiments. Automation of immunostaining, image acquisition, and image analysis were found to increase assay consistency and minimize variability while enabling the multiparameter evaluation of experimental compounds in a murine motor neuron system.
Introduction
जीवाणु क्लोस्ट्रीडियम बोटुलिनम बोटुलिनम न्यूरोटॉक्सिन, 1 आदमी के लिए जाना जाता है सबसे शक्तिशाली जैविक विषाक्त पदार्थों में से एक पैदा करता है. 7 अलग BoNT सीरमप्रकारों (BoNT / एजी) कर रहे हैं. BoNT / ए-पित्त के कारण जाल जटिल प्रोटियोलिसिस 2,3 करने neuromuscular जंक्शन पर पक्षाघात प्रेरित. जाल प्रोटियोलिसिस न्यूरोट्रांसमीटर पुटिका-झिल्ली संलयन से बचाता है और इसलिए ब्लॉक एक्सोसाइटोसिस 4 neurotransmitter. विशिष्ट जाल लक्ष्य नशा प्रक्रिया में शामिल विशेष BoNT सीरोटाइप पर निर्भर करता है. BoNT / ए और BoNT / ई फोड़ना तस्वीर 25 BoNT / सी cleaves दोनों तस्वीर 25 और syntaxin 5 जबकि. भी पुटिका जुड़े झिल्ली प्रोटीन (खलनायिका) नामक शेष सीरमप्रकारों फोड़ना synaptobrevin (. BoNT / ए यह प्राकृतिक रूप से उत्पन्न बोटुलिज़्म की एक उच्च अनुपात के लिए जिम्मेदार है के रूप में परख विकास के लिए चुना है और छोटे अणु की कार्रवाई 6. विकास की सबसे लंबी अवधि है किया गया था BoNT / ए के खिलाफ चिकित्सा विज्ञान के लिए एक प्रमुख लक्ष्य हैहमारे दवाओं की खोज कार्यक्रम और, 8-10 सक्रिय साइट प्रोटियोलिटिक अवरोधकों 7 की पहचान करने के लिए परंपरागत लक्ष्य आधारित विधियों का उपयोग किया गया है. हालांकि, कई सीरमप्रकारों और बाद जोखिम प्रभावकारिता के खिलाफ व्यापक स्पेक्ट्रम गतिविधि के साथ सक्रिय साइट अवरोधकों के निर्माण की संभावना चुनौतीपूर्ण होगा.
इसलिए हम BoNT की मध्यस्थता मोटर न्यूरॉन नशा ब्लॉक कर सकते हैं कि छोटे अणुओं की पहचान करने के लिए एक कार्यात्मक समापन बिंदु के रूप में BoNT तस्वीर 25 दरार का उपयोग करता है कि एक अभिनव, प्ररूपी दवाओं की खोज दृष्टिकोण को लागू किया है. तस्वीर 25 विवो में पक्षाघात और मारक का भविष्य कहनेवाला है तस्वीर 25 की गिरावट के रूप में, न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज के लिए आवश्यक है. उदाहरण के लिए, सेल आधारित स्क्रीनिंग विष निष्क्रियता या लक्षित कोशिकाओं के अंदर विष रास्ते के निषेध के लिए जिम्मेदार सेलुलर कारकों की नई modulators की खोज करने के लिए ले जा सकता है. प्ररूपी परख विकास में एक महत्वपूर्ण कारक physiologically प्रासंगिक जैविक मॉडल का चयन है. डब्ल्यूई और दूसरों तस्वीर 25 11- 13 की अभिव्यक्ति सहित प्राथमिक मोटर न्यूरॉन्स की immunologic चरित्र पुनरावृत्ति कि माउस भ्रूणीय स्टेम (ते) सेल व्युत्पन्न मोटर न्यूरॉन्स, का वर्णन किया है. महत्वपूर्ण बात है, इन सेलुलर सिस्टम BoNT / ए नशा करने के लिए अत्यधिक संवेदनशील हैं और विष 11,12 की सांद्रता में वृद्धि के जवाब में तस्वीर-25 की खुराक पर निर्भर दरार प्रदर्शित करता है. भेदभाव मोटर न्यूरॉन्स भी उच्च throughput प्लेट आधारित विश्लेषण के लिए पर्याप्त हैं और सेलुलर assays के एक सरणी के डिजाइन की अनुमति दी है कि मात्रा में उत्पादन कर रहे हैं.
प्ररूपी परख BoNT / माउस मोटर न्यूरॉन संस्कृति की एक नशा दौरान endogenously व्यक्त पूरी लंबाई की तस्वीर-25 की दरार यों दो अलग एंटीबॉडी का उपयोग एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस विधि है. केवल पूर्ण लंबाई तस्वीर 25 पहचानता है कि एक carboxyl टर्मिनल BoNT / एक दरार के प्रति संवेदनशील (BACS) एंटीबॉडी तस्वीर 25 की BoNT / ए मध्यस्थता प्रोटियोलिसिस के मूल्यांकन की अनुमति देता हैमाउस मोटर में अभिव्यक्ति 10 न्यूरॉन्स. एचसीआई परख का एक योजनाबद्ध आरेख चित्र 1 में दिखाया गया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
बोटुलिनम न्यूरोटोक्सिन और उनके weaponization के रिश्तेदार आसानी से उच्च शक्ति रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए अमेरिकी केंद्र द्वारा श्रेणी ए (सर्वोच्च प्राथमिकता) biothreat एजेंट के रूप में उनके वर्गीकरण में हुई है. ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding was provided by the Joint Science and Technology Office – Chemical Biological Defense (JSTO-CBD) Defense Threat Reduction Agency (DTRA) under sponsor project number CCAR# CB3675 and National Institutes of Health (1 R21 AI101387-01 and 5 U01AI082051-05).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Botulinum neurotoxin A | Metabiologics | NA | No catalog number |
| Microtitre plates | Greiner | 655946 | Poly-D-Lysine 96-well plates |
| BACs antibody | Lampire Biological | NA | |
| Microchem | National | 0255 | |
| Methanol | Thermo Scientific | A412-20 | |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Horse serum | Invitrogen | 16050 | |
| PE JANUS MDT Mini Automated Workstation | Perkin Elmer | AJMDT01 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Triton X 100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| BIII tubulin antibody | R&D Systems | BAM1195 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-1L | |
| Hoechst 33342dye | Invitrogen | 3570 | |
| Antimouse IgG | Invitrogen | A21236 | |
| Anti rabbit IgG | Invitrogen | A10042 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.4 | |
| Spotfire | Perkin Elmer | Ver 5.5 | |
| Clorox bleach | Fisher Scientific | 18-861-284 | |
| PlateStack |
Referências
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