गैर एंजाइमी, Mammospheres की सहज पीढ़ी के लिए प्री-इनवेसिव स्तन घावों के सीरम मुक्त टिशू कल्चर
Summary
बरकरार ऊतक organoids का उपयोग प्राथमिक सेल संस्कृति बहु सेलुलर में विवो microenvironment mimics कि एक मॉडल प्रणाली प्रदान करता है. हम एंजाइमी ऊतक व्यवधान के बिना, आकृति विज्ञान भेदभाव मिश्रित सेल संस्कृति प्रजातियों और प्रदर्शन perpetuates कि एक सीरम मुक्त प्राथमिक स्तन उपकला ऊतक संस्कृति मॉडल विकसित किया है. स्तन organoids> 6 महीने के लिए व्यवहार्य रहते हैं.
Abstract
सीटू (DCIS) में स्तन ductal कार्सिनोमा, परिभाषा से, मज्जा तहखाने झिल्ली को तोड़ने के बिना, स्तन वाहिनी के अंदर नियोप्लास्टिक उपकला कोशिकाओं का प्रसार है. DCIS के इनवेसिव स्तन कैंसर के लिए एक गैर-लाचार अग्रदूत है, आक्रामक कैंसर के लिए प्रगति की अनुमति है कि आणविक तंत्र और सेल आबादी पूरी तरह से नहीं जाना जाता है. आक्रमण में सक्षम पूर्वज कोशिकाओं DCIS के सेल आबादी के भीतर ही अस्तित्व में निर्धारित करने के लिए, हम ऊतक के enzymatic व्यवधान के बिना, सर्जरी के समय बाँझ मानव स्तन के ऊतकों का संग्रह और संवर्धन के लिए एक पद्धति विकसित की.
नलीपरक क्षेत्रों युक्त बाँझ स्तन के ऊतकों दिनचर्या रोग परीक्षा निम्नलिखित शल्य चिकित्सा excised स्तन के ऊतकों से काटा जाता है. DCIS युक्त ऊतक टिशू कल्चर प्रयोगशाला के लिए पोषक तत्व अमीर, एंटीबायोटिक युक्त, सीरम मुक्त माध्यम में रखा, और ले जाया जाता है. स्तन ऊतक आगे dissecte हैडी calcified क्षेत्रों को अलग करने के लिए. एकाधिक स्तन ऊतक टुकड़े (organoids) एक humidified सीओ 2 इनक्यूबेटर में एक हटाने योग्य ढक्कन और सुसंस्कृत साथ एक फ्लास्क में सीरम मुक्त माध्यम का एक न्यूनतम मात्रा में रखा जाता है. 14 दिन – उपकला और fibroblast सेल आबादी 10 के बाद organoid से उभरेगा. अनायास पर फार्म और उपकला सेल monolayer आसपास Mammospheres. विशेष सेल आबादी पड़ोसी कोशिकाओं में बाधा पहुँचा के बिना कुप्पी से सीधे काटा जा सकता है. हमारे गैर एंजाइमी टिशू कल्चर प्रणाली मज़बूती से ताजा मानव DCIS के घावों से cytogenetically असामान्य, आक्रामक पूर्वज कोशिकाओं का पता चलता है.
Introduction
स्तन नलिकाओं और अल्विओली (बगल में ductal कार्सिनोमा) के अंदर उपकला कोशिकाओं के प्रसार को आक्रामक वाहिनीपरक और lobular स्तन कार्सिनोमा के लिए एक लाचार अग्रदूत के रूप में मान्यता प्राप्त है. फिर भी, आक्रामक कैंसर के लिए प्रगति की अनुमति है कि आणविक तंत्र और सेल जनसंख्या गतिशीलता खराब समझ रहे हैं. पूर्व इनवेसिव स्तन कार्सिनोमा कोशिकाओं, या किसी भी पूर्व इनवेसिव ट्यूमर द्वारा इस्तेमाल किया अस्तित्व तंत्र, elucidating हत्या, या यहां तक कि, पूर्व आक्रामक अर्बुद 1 को रोकने के लिए चिकित्सीय रणनीतियों प्रकट हो सकता है. हालांकि, कार्यात्मक अध्ययन कर मानव पूर्व आक्रामक घावों के लिए सरल कम लागत वाली विधियों की कमी की गई है. तब्दील सेल लाइनों के इन विट्रो monolayer संस्कृति की स्थापना की एक प्रयोगशाला विधि, इन अमर सेल लाइनों के phenotype और जीनोटाइप है हालांकि प्राथमिक मानव ट्यूमर कोशिकाओं 2 की आणविक स्थिति पुनरावृत्ति करने में विफल रहता है. इसके अलावा, यहां तक कि गैर-tumorigenic एमसीएफ-10A सेल लाइन, जो RECApitulates 3-डी स्तन ग्रंथि वास्तुकला, पर्याप्त रूप से कार्यात्मक फेनोटाइप और एक व्यक्ति मरीज की पूर्व-इनवेसिव स्तन घाव 3,4 की आणविक विशेषताओं का प्रतिनिधित्व करने में विफल रहता है.
आक्रमण में सक्षम स्टेम तरह नियोप्लास्टिक कोशिकाओं सीटू (DCIS) सेल आबादी में ductal कार्सिनोमा भीतर अस्तित्व में निर्धारित करने के लिए, हम (चित्रा 1) 5 संग्रह है और सर्जरी के समय बाँझ मानव स्तन ऊतक संवर्धन के लिए एक पद्धति विकसित की. हमारे पूर्व vivo स्तन organoid संस्कृति प्रणाली अलग और ताजा मानव स्तन ductal कार्सिनोमा ऊतक 6-8 से mammosphere के गठन की कोशिकाओं के प्रचार के लिए, एंजाइमी ऊतक विघटन, तहखाने झिल्ली निकालने मैट्रिक्स, या तंतुप्रसू कमी पर भरोसा नहीं करता. हमारी नई प्रणाली सेल स्ट्रीमिंग / माइग्रेशन 5 के सिद्धांत पर आधारित है. प्रत्यक्ष स्तन नलिकाओं, और आसपास के स्ट्रोमा सीरम मुक्त पोषक मध्यम (सिर्फ ई की एक न्यूनतम मात्रा में डूबे हुए हैंसंस्कृति के माध्यम से अवगत कराया वाहिनी की कटौती की सतह के साथ, गैस विनिमय अधिकतम, लेकिन कुप्पी (चित्रा 1E-एफ) में कोई विशिष्ट अभिविन्यास में करने के लिए) वाहिनी टुकड़े को कवर करने के nough. इस संस्कृति प्रणाली की कोशिकाओं ऑटोलॉगस स्ट्रोमा और संस्कृति फ्लास्क पर वाहिनी के बाहर और / में विस्थापित करने की अनुमति देता है. केवल epidermal वृद्धि कारक (EGF), इंसुलिन, और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक पोषक मध्यम, organoid से निकलती मिश्रित सेल आबादी की वृद्धि का समर्थन करता है. टिशू कल्चर कुप्पी एक बाँझ humidified वातावरण बनाए रखते हुए, organoids और / या कोशिकाओं पूरे कुप्पी या पड़ोसी organoids बाधा पहुँचा के बिना काटा जा करने की अनुमति देता है कि एक हटाने योग्य, पुनः sealable ढक्कन है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस के साथ साथ वर्णित संस्कृति प्रणाली बुनियादी और शोधों के अध्ययन के लिए रहने वाले पूर्व आक्रामक नियोप्लास्टिक स्तन कोशिकाओं को पैदा करने के लिए एक नए मॉडल का गठन किया. अतीत में, पूर्व घातक स्तन कैंसर ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम से आंशिक रूप से समर्थन किया था (1) रक्षा विभाग के स्तन कैंसर रिसर्च प्रोग्राम (अमेरिकी सेना चिकित्सा अनुसंधान अधिग्रहण गतिविधि) # लाल को W81XVVH-10-1-0781 और वे पुरस्कार, और (2) सुसान जी Komen फाउंडेशन अनुदान IR122224446 लाल और वे करने के लिए. पैथोलॉजी समर्थन और ऊतक कमाई करने वाली कृपया Inova फेयरफैक्स पैथोलॉजी विभाग, डॉ हसन Nayer, डॉ गीता ए मेनेजीस, और डॉ चार्ल्स Bechert द्वारा प्रदान की गई थी. रोगी सहमति और नमूना खरीद expertly Inova फेयरफैक्स अस्पताल नैदानिक अनुसंधान समन्वयकों होली Gallimore, हीथ Huryk, और एमिल कमार द्वारा निर्देशित किया गया था.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Ethanol | Fisher | A405-P | prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water |
| 18 MΩ-cm water, sterile filtered | sterile filtered, Type 1 reagent grade water | ||
| 10cc plastic disposable syringe, sterile | BD | 305482 | |
| 0.2µm polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile | Thermo Scientific | 194-2520 | |
| 15ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 14-959-49B | |
| 50ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 05-539-6 | |
| 1.5ml low retention microcentrifuge tubes,sterile | Fisher | 02-681-331 | |
| nutrient medium, DMEM-F12/HEPES | Invitrogen | 11330-032 | with L-glutamine |
| Insulin, human recombinant | Roche | 11376497001 | 10mg/ml stock |
| Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Millipore | GF144 | 100µg/ml stock |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S1567 | 10mg/ml stock |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G19114 | 10mg/ml stock |
| Filtration flask and filter top, sterile | Millipore | SCGPU02RE | 0.22µm PES membrane |
| 25ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4489 | paper-plastic wrapped |
| 10ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4488 | paper-plastic wrapped |
| Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange) | CDI | MD2000 | after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard |
| Cotton tipped applicators, sterile | Fisher | 23-400-115 | single use only |
| Gauze pads, 10x10cm, sterile | Fisher | 2187 | |
| Plastic transfer pipettes, sterile, disposable | Samco | 202-20S | |
| Vinegar, white distilled | household use | 5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes | |
| #10 scalpels, sterile, disposable | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
| petri dish, sterile | Fisher | FB0875713A | |
| TPP 115cm2 flask, with removable lid | MidSci | 90652 | screw cap with filter |
| CO2 incubator | Fisher | 13-998-074 | 5% CO2, 37 oC, humidified chamber |
| inverted light microscope | Olypmus | IX51 | |
| 8M urea | Fisher | BP169-500 | optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells |
| 2X SDS tris-glycine buffer | Life Technologies | LC2676 | optional, for proteomic analysis of cultured cells |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | optional, for preparing cell smears |
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