マンモスフィアの自然発生の事前侵襲乳房病変の非酵素的、無血清組織培養
Summary
無傷の組織オルガノイドを用いた初代培養細胞は、多細胞のin vivoでの微小環境を模倣するモデル系を提供する。我々は、酵素的組織破壊することなく、形態分化混合細胞培養系統や展示を永続無血清原発性乳房上皮組織培養モデルを開発した。乳オルガノイド>は6ヶ月間生存したまま。
Abstract
その場での乳管癌（DCIS）は、定義により、コラーゲン性基底膜を破ることなく、乳管の範囲内で腫瘍性上皮細胞の増殖である。 DCISは、浸潤性乳癌に非偏性前駆体であるが、浸潤癌への進行を可能にする分子機構および細胞集団は完全には知られていない。侵入可能な前駆細胞はDCIS細胞集団内に存在かどうかを決定するために、我々は、組織の酵素を中断することなく、手術時に無菌のヒト乳房組織を採取し、培養するための方法論を開発した。
乳管セグメントを含む滅菌乳房組織は、通常の病理検査次外科的に切除された乳房組織から採取される。 DCISを含む組織は、栄養豊富な、抗生物質を含む、無血清培地に入れ、組織培養研究室に輸送される。乳房組織はさらにdissecteです石灰化領域を分離するためのdの。複数の乳房組織片（オルガノイド）は、加湿CO 2インキュベーター中で取り外し可能な蓋と、培養したフラスコ内の無血清培地の最小容積に配置されます。 14日 – 上皮および線維芽細胞集団は10の後オルガノイドから出てくる。マンモスフィアは自然に形成し、上皮細胞単層の周り。特定の細胞集団は、隣接する細胞を破壊することなく、フラスコから直接採取することができる。我々の非酵素的な組織培養系は、確実に新鮮なヒトDCIS病変からの細胞遺伝学的に異常な、侵襲性の前駆細胞を明らかにする。
Introduction
乳管および肺胞（ 非浸潤性乳管癌）の範囲内で上皮細胞の増殖は、浸潤性乳管および小葉乳癌に対する絶対的前駆体として認識されている。それにもかかわらず、浸潤癌への進行を許可する分子機構および細胞個体群動態はよく理解されていない。前浸潤乳癌細胞、または任意の前浸潤腫瘍で使用される生存メカニズムを解明することは殺す、あるいは、前浸潤腫瘍1を防止するための治療戦略を明らかにすることができる。しかし、機能的にヒト前浸潤の病変を研究するための単純な低コストの方法が欠けてきた。形質転換細胞株のin vitroでの単層培養は、確立された実験室方法であるが、これらの不死化細胞株の表現型と遺伝子型は、一次ヒト腫瘍細胞の分子の状態2を再現することができない。さらに、偶数のRecA非腫瘍形成性MCF-10A細胞株、pitulates 3-D乳腺アーキテクチャは、十分に機能的表現型および個々の患者の事前浸潤性乳癌病変3,4の分子特性を表すことができない。
侵略のできる幹様腫瘍性細胞は（DCIS） 非浸潤性乳管癌の中に存在した場合に細胞集団を決定するために、我々は手術の時点（ 図1）5 位の無菌ヒト乳房組織を採取し、培養するための方法論を開発しました。我々のex vivoでの乳癌オルガノイド培養系は、単離し、新鮮なヒト乳管癌組織6-8からマンモスフェア形成細胞を増殖させるために、酵素的組織破壊、基底膜抽出物のマトリックス、または線維芽細胞の枯渇に依存しない。当社の新しいシステムは、セルストリーミング/移行5の原理に基づいている。識別可能な乳管、及び周囲の間質は、無血清栄養培地（ちょうど電子の最小体積中に浸漬されている培地に曝露され、ダクトの切断面と、ガス交換を最大化するが、フラスコ内の不特定の向き（ 図1E-F）にする）ダクト断片をカバーするnough。この培養系は、細胞は、自己由来間質および培養フラスコ上にダクトから出て、/の中に移動することができます。唯一の上皮成長因子（EGF）、インスリン、および抗生物質を補充した栄養培地は、オルガノイドから発せられる混合細胞集団の増殖を支持する。組織培養フラスコは、無菌加湿環境を維持しながら、オルガノイドおよび/または細胞がフラスコ全体又は隣接オルガノイドを中断せずに採取することができ、取り外し可能、再シール可能な蓋を有する。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書中に記載の培養系は、基本およびトランスレーショナルリサーチ研究のために生きている前浸潤腫瘍性乳房細胞を生成するための新しいモデルを構成する。過去には、前悪性乳癌の進行は、典型的には、3つの異なる方法を用いて研究されてきた。第一の方法は、顕微解剖凍結または固定ヒト検体の組織病 理学的および遺伝的分析12-14です。第二の方法は、ヒトプレ浸潤?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、LALに防衛乳癌研究プログラム（米国陸軍医学研究買収活動）受賞＃W81XVVH-10-1-0781の（1）部門によって部分的にサポートされており、VE、及び（2）スーザンG.コーメン財団助成したLALにIR122224446とVE。病理サポートと組織グロスは親切にイノーバフェアファックス病理学科、博士ハッサンネイヤー、博士Geetha A.メネゼス、博士チャールズBechertにより提供された。患者の同意とサンプル調達が巧妙イノバフェアファックス病院臨床研究コーディネーターホリーGallimore、ヘザーHuryk、そしてエミールカマルによって導かれました。
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Ethanol | Fisher | A405-P | prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water |
| 18 MΩ-cm water, sterile filtered | sterile filtered, Type 1 reagent grade water | ||
| 10cc plastic disposable syringe, sterile | BD | 305482 | |
| 0.2µm polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile | Thermo Scientific | 194-2520 | |
| 15ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 14-959-49B | |
| 50ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 05-539-6 | |
| 1.5ml low retention microcentrifuge tubes,sterile | Fisher | 02-681-331 | |
| nutrient medium, DMEM-F12/HEPES | Invitrogen | 11330-032 | with L-glutamine |
| Insulin, human recombinant | Roche | 11376497001 | 10mg/ml stock |
| Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Millipore | GF144 | 100µg/ml stock |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S1567 | 10mg/ml stock |
| Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G19114 | 10mg/ml stock |
| Filtration flask and filter top, sterile | Millipore | SCGPU02RE | 0.22µm PES membrane |
| 25ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4489 | paper-plastic wrapped |
| 10ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4488 | paper-plastic wrapped |
| Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange) | CDI | MD2000 | after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard |
| Cotton tipped applicators, sterile | Fisher | 23-400-115 | single use only |
| Gauze pads, 10x10cm, sterile | Fisher | 2187 | |
| Plastic transfer pipettes, sterile, disposable | Samco | 202-20S | |
| Vinegar, white distilled | household use | 5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes | |
| #10 scalpels, sterile, disposable | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
| petri dish, sterile | Fisher | FB0875713A | |
| TPP 115cm2 flask, with removable lid | MidSci | 90652 | screw cap with filter |
| CO2 incubator | Fisher | 13-998-074 | 5% CO2, 37 oC, humidified chamber |
| inverted light microscope | Olypmus | IX51 | |
| 8M urea | Fisher | BP169-500 | optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells |
| 2X SDS tris-glycine buffer | Life Technologies | LC2676 | optional, for proteomic analysis of cultured cells |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | optional, for preparing cell smears |
Referências
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