Первичной культуры клеток с использованием интактных органоиды ткани обеспечивает систему модели, который имитирует многоклеточных микросреду в естественных условиях. Мы разработали модель первичной культуры груди эпителий тканей бессывороточной что увековечивает смешанные культуры клеток клоны и экспонаты дифференцированные морфологию, без нарушения ферментативной ткани. Грудь органоиды остаются жизнеспособными в течение> 6 месяцев.
Карциномы протоков молочной железы на месте (DCIS), по определению, является распространение неопластических эпителиальных клеток в пределах от груди канала, не нарушая коллагеновый базальную мембрану. В то время как DCIS не является облигатным предшественником инвазивного рака молочной железы, молекулярные механизмы, и клеточные популяции, которые позволяют прогрессирование в инвазивный рак полностью не известны. Чтобы определить, если клетки-предшественники, способные вторжения существовал в клеточной популяции DCIS, мы разработали методику сбора и культивирования стерильной ткани молочной железы человека в момент операции, без нарушения ферментативной ткани.
Стерильный ткани молочной железы, содержащий протоков сегментов собирают из хирургическим путем ткани молочной железы после рутинной патологического исследования. Ткань, содержащая DCIS находится в богатых питательными веществами, содержащей антибиотик, свободной от сыворотки среде, и доставить в лабораторию для культивирования тканей. Ткань молочной железы является дальнейшее dissected изолировать кальцинированные участки. Несколько компонентов грудного ткани (органоидами) помещают в минимальном объеме бессывороточной среде в колбе со съемной крышкой и культивируют в увлажненной CO 2 инкубаторе. Эпителиальные и фибробластов клеточные популяции выйти из Органоид после 10 – 14 дней. Mammospheres самопроизвольно образуют на и вокруг эпителиального монослоя клеток. Конкретные клеточные популяции могут быть собраны непосредственно из колбы, не нарушая соседние клетки. Наша система неферментативное культуры ткани надежно показывает цитогенетически ненормальные, агрессивные клетки-предшественники из свежих поражений человека DCIS.
Пролиферация эпителиальных клеток в пределах груди протоков и альвеол (раком протоков на месте), признается в качестве закономерной предшественником инвазивного протоков и очаговая рак молочной железы. Тем не менее, молекулярные механизмы и динамика популяции клеток, которые позволяют прогрессирование в инвазивный рак, плохо понимал. Выяснение механизмов выживания, используемые до инвазивных клеток карциномы молочной железы, или любой предварительно инвазивной опухоли, может выявить терапевтические стратегии для убийства, или даже предотвращения, предварительно инвазивных опухолей 1. Тем не менее, простые методы недорогие для функционально обучающихся человека предварительно инвазивных поражений не хватало. Хотя в пробирке монослой культуры трансформированных клеточных линий является признанным методом лабораторной, фенотип и генотип этих иммортализованных клеточных линий не может повторять молекулярную статус первичных человеческих опухолевых клетках 2. Кроме того, даже без онкогенными клеточной линии MCF-10A, который RecApitulates 3-D молочной архитектура железы, не позволяет адекватно представлять функциональную фенотип и молекулярные характеристики предварительно инвазивного поражения молочной отдельного пациента 3,4.
Чтобы определить, является ли стволовые, как опухолевые клетки, способные вторжения существовал в протоковой карциномы (DCIS) клеточной популяции, мы разработали методологию сбора и культивирования стерильной ткани молочной железы человека в момент операции (рисунок 1) 5. Наш бывший естественных груди система Органоид культура не зависит от перебоев ферментативной ткани, базальной мембраны экстракта матрицы, или истощения фибробластов, выделения и размножения mammosphere-клеток, образующих из свежих протоков молочной железы человека карциномы ткани 6-8. Наша новая система основана на принципе клеточной миграции потокового / 5. В различимые протоки молочной железы и окружающих стромы погружены в минимальном объеме бессывороточной питательной среды (просто еnough для покрытия фрагменты воздуховодов), чтобы максимизировать газообмен, с поверхности разреза канала воздействию культуральной среде, но ни в коем определенной ориентации в колбе (рис 1E-F). Эта система культуры позволяет клеткам мигрировать из канала и в / на аутологичных стромы и культуральной колбы. Питательная среда, дополненной только с фактор эпидермального роста (EGF), инсулин и антибиотиков, поддерживает рост популяций смешанных клеточных исходящих из Органоид. Тканевой культуральной колбы имеет съемную, многократно открывать и закрывать крышку, которая позволяет органоиды и / или клетки должны быть собраны без нарушения весь колбы или соседние органоиды, сохраняя при этом стерильную среду увлажненного.
Система культура описано здесь является новая модель генерации живущих предварительно инвазивных опухолевых клеток молочной железы для основных и трансляционных исследований. В прошлом, до прогрессирования злокачественной рак молочной железы, как правило, были изучены с использова…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была частично поддержана (1) Министерство обороны груди Программа исследований рака (US Army Medical Research Приобретение активность) награда # W81XVVH-10-1-0781 в LAL и VE, и (2) грант Сьюзен Г. Комен IR122224446 к Лал и VE. Поддержка патологии и ткани кассовым был любезно предоставлен Inova Fairfax патологоанатомического отделения, доктор Хасан Nayer, доктор Гита А. Менезес, и д-р Чарльз Bechert. Согласие пациента и образца по закупкам со знанием руководствуется Inova Fairfax Hospital клиническое исследование координаторов Холли Галлимор, Хизер Huryk, и Эмиль Камар.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Ethanol | Fisher | A405-P | prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water |
18 MΩ-cm water, sterile filtered | sterile filtered, Type 1 reagent grade water | ||
10cc plastic disposable syringe, sterile | BD | 305482 | |
0.2µm polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile | Thermo Scientific | 194-2520 | |
15ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 14-959-49B | |
50ml polypropylene conical tubes, sterile | Fisher | 05-539-6 | |
1.5ml low retention microcentrifuge tubes,sterile | Fisher | 02-681-331 | |
nutrient medium, DMEM-F12/HEPES | Invitrogen | 11330-032 | with L-glutamine |
Insulin, human recombinant | Roche | 11376497001 | 10mg/ml stock |
Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant | Millipore | GF144 | 100µg/ml stock |
Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S1567 | 10mg/ml stock |
Gentamicin sulfate | Sigma-Aldrich | G19114 | 10mg/ml stock |
Filtration flask and filter top, sterile | Millipore | SCGPU02RE | 0.22µm PES membrane |
25ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4489 | paper-plastic wrapped |
10ml sterile, disposable pipettes | Fisher | 4488 | paper-plastic wrapped |
Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange) | CDI | MD2000 | after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard |
Cotton tipped applicators, sterile | Fisher | 23-400-115 | single use only |
Gauze pads, 10x10cm, sterile | Fisher | 2187 | |
Plastic transfer pipettes, sterile, disposable | Samco | 202-20S | |
Vinegar, white distilled | household use | 5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes | |
#10 scalpels, sterile, disposable | Thermo Scientific | 31-200-32 | |
petri dish, sterile | Fisher | FB0875713A | |
TPP 115cm2 flask, with removable lid | MidSci | 90652 | screw cap with filter |
CO2 incubator | Fisher | 13-998-074 | 5% CO2, 37 oC, humidified chamber |
inverted light microscope | Olypmus | IX51 | |
8M urea | Fisher | BP169-500 | optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells |
2X SDS tris-glycine buffer | Life Technologies | LC2676 | optional, for proteomic analysis of cultured cells |
Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | optional, for preparing cell smears |