Fjernelsen af øjne, også kaldet enucleation, giver en nyttig strategi til at studere aspekter af visuel, cross-modal, og udviklingsmæssige plasticitet langs pattedyr visuelle system, da det inducerer irreversibel partiel (monokulære) eller fuldstændig (kikkert) synstab. Her beskriver vi en meget reproducerbar og enkel tilgang til at udføre in vivo enucleation.
Enucleation eller kirurgisk fjernelse af et øje kan generelt betragtes som en model for nerve deafferentiering. Det giver et værdifuldt værktøj til at studere de forskellige aspekter af visuel, cross-modal og udviklingsmæssige plasticitet langs pattedyr visuelle system 1-4.
Her vil vi demonstrere en elegant og enkel teknik til fjernelse af den ene eller begge øjne i musen, som er valideret i mus af 20 dage gamle, op til voksne. Kort fortalt er en desinficerede buet pincet bruges til at klemme synsnerven bag øjet. Efterfølgende cirkulære bevægelser udføres for at snøre synsnerven og fjern øjeæblet. Fordelene ved denne teknik er høj reproducerbarhed, minimal eller ingen blødning, hurtig postoperative forløb og en meget lav tærskel læring for forsøgslederen. Derfor kan en stor mængde af dyr manipuleret og behandles med minimal indsats. Arten af teknikken kan fremkalde mindre beskadigelsenethinden under proceduren. Denne bivirkning gør denne metode mindre egnet i forhold til Mahajan et al. (2011) 5, hvis målet er at indsamle og analysere retinavæv. Desuden er vores metode er begrænset til post-øjenåbnende aldre (mus: P10 – 13 og fremefter), da øjeæblet skal fortrænges fra stikkontakten uden at fjerne øjenlåg. In vivo enucleation teknikken beskrevet i dette manuskript er for nylig blevet anvendt med succes med mindre modifikationer i rotter og synes nyttigt at studere afferente visuelle pathway gnavere i almindelighed.
Fjernelse af et øje og derved uigenkaldeligt destructing den sensoriske receptor overflade (nethinden), pålægger et betydeligt tab af sanseindtryk ad visuel vej. Den enucleation model i unge og voksne visuelle system har vist sig at være værdifulde i at forstå udviklingen, plasticitet og funktion af forskellige visuelle centre 1-4. De molekylære, cellulære og fysiologiske konsekvenser af denne sensoriske afsavn kan give indsigt i, hvordan en normal udvikling er reguleret, og hvor der er etableret kortikale kredsløb klare og ændre deres struktur og funktion som reaktion på en så omfattende ændring i erfaring.
Der findes forskellige metoder til visuel afsavn og de har alle deres særlige fordele i synet-relateret forskning. For eksempel mørk opdræt specifikt eliminerer visuelt drevet aktivitet endnu påvirker det ikke den spontane retinal aktivitet. Ligeledes låg suturer eller eye patches fjern mønstrede udstyr og forretnil input uden at forstyrre spontan aktivitet, men de tillader spredte lys indtrængen gennem de lukkede øjne. Disse metoder er reversible og har vist sig at være værdifulde i at forstå den rolle, mønstrede vision og lavt niveau korrelation af binokulære inputs sculpting kortikale kredsløb under udviklingen 6-8. I glaukom forskning har synsnerven knuse model i voksne dyr er ofte blevet brugt, fordi det etablerer en fremadskridende tab af retinale ganglieceller indgange, der udgør synsnerven 9,10. På den anden side, enucleation, hvor øjet og dermed nethinden er fuldstændigt og øjeblikkeligt fjernet, er et passende valg af afsavn, når målet er at irreversibelt at fjerne både spontan og mønstret syn på én gang. Det inducerer også en robust aktivitet ubalance intraokulært som kan øge signal-støj-forholdet i aktivitet kortlægningsundersøgelser 11,12. Sammenligning funktionelle og strukturelle ændringer som reaktion på enucleation med thOSE efter afsavn ved mindre drastiske metoder såsom låg sutur for eksempel, kan også udsætte nye indsigter i den rolle, spontan retinal aktivitet i både homeostatiske og synaptiske typer af plasticitet.
Enucleation udløser et tab af trofiske påvirkninger i direkte retinale mål. For eksempel er BDNF niveauer betydeligt nedreguleret i lateral geniculate nucleus (LGN) og overlegen colliculus af voksne udkernet rotter 13. Reaktive ilt arter, der fungerer som messenger-molekyler til at mediere strukturelle ombygninger, blev også påvist i subkortikale strukturer voksne rotter visuelle system 14. Desuden mikroglial og astroglial aktivering på tværs af forskellige subkortikale visuelle målstrukturerne i musen forekomme i en bestemt stilling-enucleation tidsramme på en uge 15. Sammen optiske deafferentiering resultater i forskellige subkortikale reaktioner på glia, strukturelle og molekylære niveau. Trods disse subkortikaleffekter, er det ikke nødvendigvis implicere virkninger på det kortikale niveau 16. Bemærkelsesværdigt, cross-modal kortikal plasticitet, herunder ændringer i andre sensoriske områder ved siden af en styrkelse af ikke-visuelle input til frataget visuelle cortex opstå efter både monokulære (ME) 3,4,17,18 og kikkert (BE) 1,17 enucleation.
Bortset fra at bidrage til visuel neuroscience kan enucleation som en slags deafferentiering anvendes til at studere ligevægt mellem neurobeskyttende 19 og neurodegenerative 20-22 egenskaber i det centrale nervesystem.
Forskellige procedurer til at udføre enucleation er allerede beskrevet i litteraturen. Visse metoder til in vivo mig i rotter og mus er mindre ligetil på grund af unødvendigt sektionering af positionsressourcer muskler og væv 23-25. Andre publikationer såsom Mahajan mfl. (2011) 5 giver en detaljeret protokol hjælp stump dissektion for en high-throughput samling af øjnene for at studere genotype-fænotype korrelationer, sandsynligvis efter slagtning. For deres formål, metoden er praktisk og hurtig. Men denne metode er mindre egnet til in vivo enucleation når man vælger at studere afferente visuel vej efter enucleation (levende dyr) snarere end selve øjet. I sådan en indstilling, post-enucleation overlevelse er af stor betydning. Også minimal in vivo skader og bevarelse af synsnerven og orbital væv er gunstig. Her præsenteres en alternativ enucleation metode, mere ligner den beskrevet af Faguet et al (2008) 26, der tilbyder visse fordelagtige egenskaber:. Det er forbundet med en hurtig postoperative forløb og er kendetegnet ved en meget lav tærskel læring for forskere. I almindelighed forskellige metoder supplerer hinanden, afhængigt af fokus for efterfølgende forskning: øje morfologi eller visuel vej forskning.
ve_content "> Sammenfattende kan enucleation anvendes fra vision forskning mod undersøgelser af homeostatisk og tværs modal hjernens plasticitet, gliøse respons egenskaber og Axon stabilitet. I denne visualiseret artikel viser vi en realistisk og pålidelig metode til in vivo øje enucleation i musen.For at udføre en vellykket enucleation ifølge vores metode, de mest kritiske skridt til at overveje, er: 1) ved hjælp af en pincet med en buet og savtakket spids af passende størrelse; 2) udførelse af enucleation på en glat og tør overflade; og 3) gradvis at fremskynde de cirkulære bevægelser i retning med den mindste friktion.
For en effektiv resultat er det vigtigt at bruge en passende tang kendetegnet ved en buet og savtakket spids (foretrukken spids størrelse: mus: 0,5 x 0,4 mm, rotte: 2.15 x 1,3 mm). Krumningen giver mulighed for en nem adgang til synsnerven efter øjeæblet fordrivelse og er nødvendig for korrekt hånd placering, når du udfører de cirkulære bevægelser. Glatte tip er ikke anbefales, da de mangler den nødvendige greb, når du holder den optiske nerve. Manglende holde synsnerven korrekt under de cirkulære bevægelser resulterer i bristning af den ophthalmiske arterie, dårlig frigørelse af øjet og dermed dårlig reproducerbarhed.Det anbefales derfor at første praksis denne teknik på aflivet dyr til optimering af tangen håndtering for at sikre maksimal dyrevelfærd, når anvendelse af den metode in vivo. Vellykket øje enucleation er for nylig også blevet udført på rotter i vores laboratorium under anvendelse af samme teknik, undtagen at dreje dyrekroppen manuelt og holde pincet stille.
En begrænsning af den teknik er, at det muligvis kunne beskadige nethinden. Derfor er denne metode mindre egnet til opsamling nethinder at udføre histologi 5. Desuden er vores metode er begrænset til at sende øjenåbnende aldre siden øjeæblet skal fortrænges fra stikkontakten uden at fjerne eller skære øjenlågene.
Eye enucleation i forskellige arter, herunder gnavere, udføres rutinemæssigt ved hjælp af alternative metoder, som ofte medfører fjernelse af øjenlåg og skære synsnerven 18,23-25. Disse methods tendens til at være mere invasive og har en højere indlæringskurve end den her beskrevne teknik. Uden behov for at fjerne eller suturering øjenlågene, er postoperativt inddrivelse tid minimeres, hvilket resulterer i højere dyrevelfærd og mere reproducerbare resultater.
The authors have nothing to disclose.
We thank Ellen Ytebrouck for her valuable information regarding method application in rat. This work was supported by the Research Council of the KU Leuven (OT09/22) and the Fund for Scientific Research-Flanders (FWO Vlaanderen). Jeroen Aerts is supported by a Ph.D. fellowship of the Agency for Innovation through Science and Technology Flanders (IWT Vlaanderen) and Julie Nys by a Ph.D. grant from FWO Flanders.
Ketamine hydrochloride (Anesketin) | Dechra Veterinary Products (Eurovet) | BE-V136516 | |
Medetomidine hydrochloride (Domitor) | Orion Corporation (Janssen Animal Health) | BE-V151742 | |
Atipamezol hydrochloride (Antisedan) | Orion Corporation (Elanco Animal Health) | BE-V153352 | |
Meloxicam (Metacam) | Boehringer Ingelheim Vetmedica | N/A | |
Eye ointment (Fucithalmic) | Leo Pharma nv-sa | BE 144654 | |
Moria MC31 Forceps – Serrated Curved | Fine Science Tools | 11370-31 | For application in the mouse. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated. |
Narrow Pattern Forceps – Curved | Fine Science Tools | 11003-13 | For application in the rat. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated. |
Hemostatic cotton wool | Qualiphar | N/A | Other hemostatic agents are equally suitable (e.g. Viscostat, #649, Ultradent Products) |