Het verwijderen van de ogen, ook wel enucleatie, een bruikbare strategie om aspecten van de visuele, cross-modale en ontwikkelingsplasticiteit bestuderen langs de zoogdieren visuele systeem is omdat het leidt tot onomkeerbare gedeeltelijke (monoculair) of volledige (binoculair) verlies van gezichtsvermogen. Hier beschrijven we een zeer reproduceerbare en duidelijke aanpak om te presteren in vivo enucleatie.
Enucleatie of de chirurgische verwijdering van een oog kan in het algemeen worden beschouwd als een model voor zenuw deafferentatie. Het biedt een waardevol hulpmiddel om de verschillende aspecten van de visuele, cross-modale en ontwikkelingsplasticiteit bestuderen langs de zoogdieren visuele systeem 1-4.
Hier tonen we een elegante en eenvoudige techniek voor het verwijderen van een of beide ogen in de muis, die wordt gevalideerd in muizen van 20 dagen oud tot volwassenen. In het kort wordt een gedesinfecteerde gebogen pincet gebruikt om de oogzenuw achter het oog klemmen. Vervolgens worden cirkelvormige bewegingen uitgevoerd aan de oogzenuw vernauwen en verwijder de oogbol. De voordelen van deze techniek zijn hoge reproduceerbaarheid, weinig tot geen bloeden, snelle post-operatief herstel en een zeer lage leerdrempel voor de experimentator. Derhalve kan een grote hoeveelheid dieren worden gemanipuleerd en verwerkt met minimale inspanning. De aard van de techniek lichte schade veroorzakenhet netvlies tijdens de procedure. Deze bijwerking is deze methode minder geschikt ten opzichte Mahajan et al. (2011) 5 als het doel is het verzamelen en analyseren van retinale weefsel. Ook is onze methode beperkt tot post-eye opening leeftijden (muis: P10 – 13 en verder), omdat de oogbol moet worden verplaatst uit het stopcontact, zonder het verwijderen van de oogleden. De in vivo enucleatie techniek dit manuscript beschreven is onlangs succesvol toegepast met kleine modificaties in ratten en nuttig lijkt de afferente gezichtsbaan knaagdieren studie in het algemeen.
Een oog verwijderen en daarmee onherroepelijk vernietigende de receptor oppervlak zintuiglijke (retina), legt een aanzienlijk verlies van zintuiglijke input langs de visuele banen. De enucleatie model in de juveniele en volwassen visuele systeem is nuttig gebleken om inzicht in de ontwikkeling, plasticiteit en functie van verschillende visuele centra 1-4 zijn. De moleculaire, cellulaire en fysiologische gevolgen van deze sensorische deprivatie kan inzicht in hoe de normale ontwikkeling is geregeld en hoe gevestigde corticale circuits omgaan en hun structuur en functie te veranderen in reactie op een dergelijk ingrijpende verbouwing in ervaring te bieden.
Verschillende methoden van visuele deprivatie bestaan en ze hebben allemaal hun specifieke voordelen in visie-gerelateerd onderzoek. Bijvoorbeeld donkere opfok specifiek elimineert visueel gedreven activiteit nog is het niet van invloed op de spontane retinale activiteit. Ook deksel hechtingen of oogkleppen verwijderen patroon Visual ingang zonder spontane activiteit te storen, maar ze laten verspreide lichtinval door de gesloten ogen. Die methoden zijn omkeerbaar en is aangetoond waardevol in het begrijpen van de rol van patroon visie en low-level correlatie van binoculair ingangen in beeldhouwen corticale circuits tijdens de ontwikkeling 6-8 te zijn. In glaucoom onderzoek heeft de oogzenuw verpletteren model volwassen dieren veel gebruikt omdat het wordt een progressief verlies van retinale ganglioncellen ingangen met oogzenuw 9,10 opleveren. Anderzijds, enucleatie, waar het oog en dus de retina volledig en onmiddellijk verwijderd, is de geschikte keuze van deprivatie wanneer het de bedoeling is irreversibel verwijderen zowel spontaan gevormde visie tegelijk. Het induceert ook een sterke intraoculaire activiteit onbalans die de signaal-ruisverhouding in activiteit cognitieve experimenten 11,12 kan verbeteren. Het vergelijken van de functionele en structurele veranderingen in reactie op enucleatie met those na ontbering minder drastische methoden zoals deksel hechtdraad kan bijvoorbeeld ook nieuwe inzichten in de rol van spontane retinale activiteit zowel homeostatische en synaptische plasticiteit soorten bloot.
Enucleatie veroorzaakt een verlies van trofische invloeden direct retinale targets. Zo worden BDNF significant neerwaarts gereguleerd in de laterale geniculate nucleus (LGN) en superieure colliculus van volwassen ratten ontkernde 13. Zuurstofradicalen, die fungeren als boodschapper moleculen structurele verbouwing bemiddelen, werden ook aangetroffen in subcorticale structuren van de volwassen rat visuele systeem 14. Bovendien, microglia en astrogliale activatie over verschillende subcorticale visuele doelwit structuren in de muis zich voordoen in een specifieke post-enucleatie tijdsbestek van een week 15. Samen optische deafferentatie resultaten in verschillende subcorticale reacties op de gliacellen, structurele en moleculair niveau. Ondanks deze subcorticaleeffecten, is het niet per se impliceren effecten op de corticale niveau 16. Opmerkelijk, cross-modale corticale plasticiteit, met inbegrip van wijzigingen in andere zintuiglijke gebieden naast de versterking van de niet-visuele input voor de kansarme visuele cortex optreden na zowel monoculair (ME) 3,4,17,18 en binoculair (BE) 1,17 enucleatie.
Naast de bijdrage aan visuele neurologie, kan enucleatie als type deafferentatie worden om de balans tussen neuroprotectieve 19 en neurodegeneratieve 20-22 eigenschappen van het centrale zenuwstelsel te onderzoeken.
Verschillende procedures tot enucleatie voeren zijn reeds beschreven in de literatuur. Bepaalde methoden voor in vivo ME bij ratten en muizen zijn minder eenvoudig als gevolg van onnodige snijden van orbitale spieren en weefsel 23-25. Andere publicaties zoals Mahajan et al. (2011) 5 een gedetailleerd protocol gebruikt stompe dissectie voor een high-throughput verzameling van ogen voor de genotype-fenotype correlaties waarschijnlijk post-mortem onderzoek. Voor hun doel, de methode is handig en snel. Deze methode is minder geschikt voor in vivo enucleatie wanneer men kiest voor de afferente gezichtsbaan volgende enucleatie (in levende dieren) in plaats van het oog zelf. In een dergelijke omgeving, post-enucleatie overleven is van groot belang. Ook minimaal in vivo schade en het behoud van de oogzenuw en orbitale weefsel is gunstig. Hier presenteren we een alternatieve methode enucleatie, meer vergelijkbaar met die beschreven door Faguet et al (2008) 26, dat bepaalde voordelige eigenschappen heeft:. Het wordt geassocieerd met een snelle post-operatief herstel en wordt gekenmerkt door een zeer lage leerdrempel voor onderzoekers. In het algemeen zijn verschillende methoden zijn complementair, afhankelijk van de focus van het daaropvolgende onderzoek: oog morfologie of visuele pathway onderzoek.
ve_content "> Samenvattend kan enucleatie worden toegepast vanaf vision onderzoek naar onderzoek van homeostatische en cross-modale plasticiteit van het brein, gliale respons eigenschappen, en axon stabiliteit. In dit gevisualiseerd artikel tonen we een haalbare en betrouwbare methode voor in vivo oog enucleatie in de muis.Om een succesvolle enucleatie voeren volgens onze werkwijze, de meest kritische stappen te overwegen zijn: 1) met een tang met een gebogen en gekartelde uiteinde van de juiste grootte; 2) het uitvoeren van de enucleatie op een glad en droog oppervlak; en 3) geleidelijk versnellen van de cirkelvormige bewegingen in de richting met de minste wrijving.
Voor een effectief resultaat is het essentieel om een geschikte forceps gekenmerkt door een gebogen en gekartelde punt gebruiken (tip Gewenst: muis: 0.5 x 0.4 mm, rat: 2.15 x 1.3 mm). De kromming maakt een eenvoudige toegang tot de oogzenuw na eyeball verplaatsing en is nodig voor een juiste plaatsing van de hand bij het uitvoeren van de cirkelvormige beweging. Gladde tips worden niet aanbevolen, omdat zij niet over de nodige grip bij het vasthouden van de oogzenuw. Als de oogzenuw goed houden tijdens het cirkelvormige bewegingen resulteert in breuk van de oftalmische arterie, slecht loslaten van het oog en dus slechte reproduceerbaarheid.Daarom wordt aanbevolen om eerst praktijk deze techniek op euthanized dieren voor optimalisering van de forceps hanteren om maximale dierenwelzijn garanderen zodra toepassing van de werkwijze in vivo. Succesvolle eye enucleatie is onlangs ook uitgevoerd in de rat in ons laboratorium met behulp van dezelfde techniek, behalve voor het handmatig draaien van de dierlijke lichaam en houden van de forceps stilstaat.
Een beperking van de techniek is dat het mogelijk de retina beschadigen. Daarom is deze methode minder geschikt voor het verzamelen netvlies histologie 5 uitgevoerd. Bovendien is onze werkwijze beperkt tot opening eye leeftijden onderbrengen omdat de oogbol moet worden verplaatst uit het stopcontact zonder het verwijderen of afsnijden van de oogleden.
Eye enucleatie in verschillende soorten, waaronder knaagdieren, wordt routinematig uitgevoerd met behulp van alternatieve werkwijzen, die vaak leiden tot de verwijdering van de oogleden en snijden van de oogzenuw 18,23-25. Deze methods de neiging om meer invasieve te zijn en hebben een hogere leercurve dan de hier beschreven techniek. Zonder de noodzaak voor het verwijderen van of het hechten van de oogleden, is het na de operatie hersteltijd tot een minimum beperkt, wat resulteert in een beter welzijn van dieren en meer reproduceerbare resultaten.
The authors have nothing to disclose.
We thank Ellen Ytebrouck for her valuable information regarding method application in rat. This work was supported by the Research Council of the KU Leuven (OT09/22) and the Fund for Scientific Research-Flanders (FWO Vlaanderen). Jeroen Aerts is supported by a Ph.D. fellowship of the Agency for Innovation through Science and Technology Flanders (IWT Vlaanderen) and Julie Nys by a Ph.D. grant from FWO Flanders.
Ketamine hydrochloride (Anesketin) | Dechra Veterinary Products (Eurovet) | BE-V136516 | |
Medetomidine hydrochloride (Domitor) | Orion Corporation (Janssen Animal Health) | BE-V151742 | |
Atipamezol hydrochloride (Antisedan) | Orion Corporation (Elanco Animal Health) | BE-V153352 | |
Meloxicam (Metacam) | Boehringer Ingelheim Vetmedica | N/A | |
Eye ointment (Fucithalmic) | Leo Pharma nv-sa | BE 144654 | |
Moria MC31 Forceps – Serrated Curved | Fine Science Tools | 11370-31 | For application in the mouse. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated. |
Narrow Pattern Forceps – Curved | Fine Science Tools | 11003-13 | For application in the rat. Any forceps with similar dimensions can be used as long as the tip is curved and serrated. |
Hemostatic cotton wool | Qualiphar | N/A | Other hemostatic agents are equally suitable (e.g. Viscostat, #649, Ultradent Products) |