מדידות בזמן אמת של חלבון ממברנה: קולט אינטראקציות שימוש תהודה Plasmon Surface (SPR)
Summary
משטח Plasmon תהודה (SPR) היא שיטה ללא תווית לזיהוי אינטראקציות ביו-מולקולרי בזמן אמת. במסמך זה, פרוטוקול לחלבון קרום: ניסוי אינטראקציה קולט מתואר, תוך דיון על היתרונות וחסרונות של השיטה.
Abstract
Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed ‘ligand’) is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the ‘analyte’) is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method’s high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods.
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter’s cognate substrate binding protein).
Introduction
אינטראקציות חלבון-חלבון (PPI); ההיווצרות והניתוק של קומפלקסי חלבונים, הם אירועי מפתח בתהליכים ביולוגיים רבים (למשל, שכפול, שעתוק, תרגום, איתות, תקשורת תאי תאים). מחקרים חצי כמותית של PPI לעתים קרובות מתבצעים באמצעות נפתחים או ניסויים חיסוניים ממטרים. עם זאת, בטכניקות אלה (ודומים) מוגבלים בטווח של זיקות שניתן למדוד (מייקרו הנמוך וזיקה גבוהה יותר) בשל צעדי הכביסה כי הם טבועים בטכניקות כאלה. טכניקות "נקודת סיום" כזה לא יכול לזהות אינטראקציות זיקה חולפות או נמוכות, כי הם לעתים קרובות השלכות ביולוגיות גדולות. בנוסף, ההחלטה הזמנית של גישות כגון מוגבלת מאוד, בדרך כלל בסדרי גודל איטי יותר מאשר שיעורי התגובה. SPR מתגבר חסרונות אלה בשל רגישותו והחלטה זמנית מעולה 1,2. SPR הוא שיטה ללא תווית, ובתור שכזואינטראקציה מולקולרית ניתן למדוד (כל עוד ניתן לאתר את שינויי המסה). בנוסף למדד המחירים ליצרן, זה כבר נעשה שימוש נרחב כדי לאפיין חלבון ליגנד, חלבון תרופתי (או מולקולה קטנה), חלבון ה- DNA, ואינטראקציות החלבון-RNA 3-5. תוצאות נרשמות וזממו בזמן אמת, המאפשר שינוי מהיר של תנאי ניסוי ועיצוב ניסיוני גמיש.
העיקרון הפיזי מאחורי מכשירים מבוססים SPR הוא הניצול של מערכת אופטית המודדת שינוי של מקדם השבירה על פני השטח החיישן על המסה משתנה 2. אחד מהשותפים באינטראקציה (ליגנד להלן) הוא משותק על גבי שבב מטריצת פולימר והמולקולה השנייה (אנליטי להלן) הוא זרם על פני השטח. אנליטי מחייב ליגנד משנה את המסה על פני השטח השבב. שינוי מסה זו באופן ישיר ויחסי הקשורים לשינויים במדד השבירה של פני השטח. התוצאות נרשמות בזמן אמת ומוצג כיחידות תגובה (RU) כפונקציה של זמן. כגון עלילה נקראת sensogram (למשל, איור 1). מאז SPR עוקב אחרי מסלול הזמן השלם של האינטראקציה, קבועי קצב הקינטית מראש שיווי משקל נגזרים, בנוסף לשיווי משקל זיקות. כפי שיפורט להלן, מראש שיווי משקל התנהגותה של מערכת נתונה מחזיקה הרבה מידע, ומספקת נקודת מבט שונה מאוד משיווי המשקל לבד. ברגע שהמערכת מכוילת, ניסויים הם מהירים מאוד ודורשים רק כמויות קטנות של חומר חלבונים (מיקרוגרם לננוגרם כמויות). איסוף המידע הקינטית המלא של מערכת נתונה ניתן להשיג בימים. הרגישות הגבוהה של SPR מאפשרת מדידות שאינן אפשריים באמצעות כל טכניקה אחרת 6. עם זאת, רגישות גבוהה זה היא "חרב פיפיות" שכן הוא יכול להיות מקור עיקרי לנתונים חיוביים כוזבים. כל גורם המשפיע על המדד רעיוני נרשם וזמם על sensogram. ככזה, apבקרות propriate יש להשתמש כדי לחסל שווא-תוצאות חיוביות, ותמיכה מגישות משלימות מומלצת מאוד.
איור 1 מדגים את ההתקדמות של ניסוי SPR באמצעות שבב חיישן מצופה נת"ע. Sensogram בפנל מראה את הזריקה של יוני ניקל על מטריצת נת"ע (נתונים unsubtracted), וBD לוחות להציג את הנתונים לאחר הפחתת האות נגזרת מתא הבקרה השלילי. אדום וחצים כחולים מראים תחילת הזרקה וסופו של דבר, בהתאמה. קיבוע של יגנד על השבב משנה בהדרגה את המסה עד ההזרקה מסתיימת. הרמה היציבה נצפתה לאחר סיום ההזרקה של יגנד משקפת את העמותה היציבה של יגנד אל פני השטח (איור 1, מחזור 2). ברגע שבסיס יציב מושגת חיץ מוזרק מעל ליגנד ותא ההתייחסות (איור 1, מחזור 3) הזרקת .זה משמש כ'ביקורת ריקה ", ויהיהנגרע במהלך ניתוח. על הזריקה, שינויים קלים נרשמים, המשקפים זרימת המונית דרך השבב. לאחר מכן, במחזור נפרד (איור 1 ב, מחזור 4), אנליטי מוזרק; העלייה ההדרגתית בRU מייצגת עמותה של אנליטי ליגנד. אתרי הקישור הופכים בהדרגה הכבושה עד שיגיע לשיווי המשקל. ברגע שההזרקה מסתיימת, ירידה בRUS משקפת ניתוק של המתחם. מsensograms כזה ניתן לגזור קבוע שיעור ריבית לפני שיווי משקל ושיווי המשקל (ראה בהמשך). איור 1 מתאר אינטראקציה בין חולפת יגנד ואנליטי. כאשר האינטראקציה היא יציבה יותר, הירידה ברמת RU היא איטית יותר, המשקף ד k נמוך יותר.
במסמך זה, אנו מתארים ניסוי SPR שנועד לאפיין את האינטראקציה בין טרנספורטר קרום (חומר ניקוי solubilized) והשותף הפונקציונלי שלה, מצעו המקור שלה מחייב חלבון 6,7. Mod נבחרמערכת אל היא טרנספורטר קלטת מחייבת ATP (ABC), ModBC-של fulgidus Archeaglobus. מערכת זו נבחרה לתוצאות מאוד לשחזורה, גבוהה יחס אות לרעש, וקלאסי "on / off" שיעורים. בנוסף, מובילי homologues ABC זמינים לשרת בקרות שליליות חשובות. טרנספורטר, ModBC (ליגנד) מופק מקרום שימוש בחומרי ניקוי, מטוהר ומשותק על השבב. שותפו המסיס באינטראקציה, Moda, הוא אנליטי. כיגנד שליטה שלילי, RbsBC טרנספורטר ABC שונה משמש ("ליגנד B").
Protocol
Representative Results
Discussion
SPR הוא שיטה רגישה מאוד ללמוד אינטראקציות מולקולריות, ולעתים קרובות היא הגישה היחידה שמספקת ניטור של אינטראקציות חולפות (עדיין חשובות) בזמן אמת. דוגמה לכך היא האינטראקציה החולפת המוצגת כאן, שלא ניתן הייתה לזהות בכל דרך אחרת (מבחני נפתחים, מבחני שקיעת יפוזומים 6). ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research at the Lewinson lab is supported by grants from the Israel Academy of Science, the Rappaport Institute for Biomedical research, the Meriuex Research Foundation, and the Marie Curie career reintegration grant (OL). EV is supported by the Fine scholarship and by the Technion Faculty of Medicine. NLL is supported by grants from the Israel Academy of Science.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
| Sensor Chip NTA | GE Healthcare | 14100532 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | ||
| Biacore T200 Software | GE Healthcare | ||
| Nickel chloride | Sigma | N6136 | |
| Sodium tungstate dihydrate | Sigma | T2629 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab LTD. | 19030591 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma | 05030 | |
| Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Hydrochloric acid | GADOT | 7647-01-0 | |
| Nylon (NY) Membrane Filter | Sartorius | 25007–47——N | |
| ModBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| RbsBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| ModA Substrate Binding Protein | Lewinson lab |
Referências
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. H. i. g. h. e. r. -. t. h. r. o. u. g. h. p. u. t. label-free, real-time molecular interaction analysis. Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).
- Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161 (2012).
- Kyo, M., et al. Evaluation of MafG interaction with Maf recognition element arrays by surface plasmon resonance imaging technique. Genes to Cells. 9, 153-164 (2004).
- Katsamba, P. S., Park, S., Laird-Offringa, I. A. Kinetic studies of RNA–protein interactions using surface plasmon resonance. Methods. 26, 95-104 (2002).
- Vigonsky, E., Ovcharenko, E., Lewinson, O. Two molybdate/tungstate ABC transporters that interact very differently with their substrate binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 5440-5445 (2013).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
- Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique. Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).
- Mori, T., et al. Evaluation of protein kinase activities of cell lysates using peptide microarrays based on surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 375, 223-231 (2008).
- Mol, N., Fischer, M. E., Mol, N. J., Fischer, M. J. E. . Surface Plasmon Resonance Vol. 627 Methods in Molecular Biology. 1, 1-14 (2010).
- Van Der Merwe, P. A. . Surface plasmon resonance. Protein– ligand interactions: hydrodynamics and calorimetry. , 137-170 (2001).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
