Real Time Målinger av Membrane Protein: Receptor Interaksjoner Bruke Surface plasmonresonans (SPR)

Summary

Overflate-plasmonresonans (SPR) er en etikett-fri fremgangsmåte for detektering av bio-molekylære vekselvirkninger i sanntid. Heri, en protokoll for en membran protein: er reseptorinteraksjon eksperiment beskrevet, mens de diskuterer fordeler og ulemper med teknikken.

Abstract

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed ‘ligand’) is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the ‘analyte’) is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method’s high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods.

SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter’s cognate substrate binding protein).

Introduction

Protein-protein interaksjoner (PPI); dannelse og dissosiasjon av proteinkomplekser, er sentrale hendelser i mange biologiske prosesser (f.eks, replikering, transkripsjon, oversettelse, signalisering, celle-celle kommunikasjon). Semi-kvantitative studier av PPI blir ofte utført ved hjelp av rullegardin eller immunutfellingen eksperimenter. Imidlertid er disse (og liknende) teknikker er begrenset i området fra affiniteter som kan måles (lavt mikromolområde og høyere affinitet) på grunn av vasketrinnene som er iboende i slike teknikker. Slike "end-point" teknikker kan ikke identifisere forbigående eller lav affinitet interaksjoner som ofte er av stor biologiske konsekvenser. I tillegg er den tidsmessige oppløsningen av slike metoder ytterst begrenset, vanligvis flere størrelsesordener langsommere enn utbredelsen av reaksjonen. SPR overvinner disse mangler på grunn av sin økt følsomhet og overlegen tidsmessig oppløsning ^1,2. SPR er en etikett-fri metode, og som sådanmolekylær interaksjon kan måles (så lenge masse endringene kan bli detektert). I tillegg til PPI, har det vært mye brukt for å karakterisere protein-ligand, protein-medikament (eller lite molekyl), protein-DNA og protein-RNA interaksjoner ^3-5. Resultatene er registrert og plottet i sann tid, noe som muliggjør hurtig endring av eksperimentelle betingelser og eksperimentelle fleksibel utforming.

Den fysiske prinsippet bak SPR baserte instrumenter er utnyttelsen av et optisk system som måler en endring av brytningsindeksen på sensoroverflaten når massen endres ^2. En av de samvirkende partnere (heretter ligand) immobilisert på en polymer matrise chip og andre molekyl (heretter analytt) føres over overflaten. Analytt å bindes til liganden forandrer massen på chip overflaten. Denne masseendring er direkte og proporsjonalt relatert til endringer i brytningsindeksen til overflaten. Resultatene er plottet i sanntid ogpresenteres som respons heter (RU), som en funksjon av tid. Et slikt plott er betegnet en sensogram (f.eks, figur 1). Siden SPR følger hele tidsforløpet av interaksjonen, blir pre-likevektskinetiske hastighetskonstanter avledet, i tillegg til likevekt affiniteter. Som beskrevet nedenfor, har den pre-likevekt oppførselen til et gitt system mye informasjon, og gir et helt annet perspektiv enn likevekt alene. Når systemet er kalibrert forsøk er meget rask og krever bare små mengder av proteinmaterialet (mikrogram til nanogram mengder). Oppsamling av det komplette bevegelsesinformasjon for et gitt system kan oppnås i løpet av dager. Den høye følsomheten SPR gir målinger som ikke er mulig å bruke noen annen teknikk ^6. Dette er imidlertid høy følsomhet en "tveegget sverd" siden det kan være en viktig kilde for falske positive data. Annen faktor som påvirker reflekterende indeksen er registrert og plottet på sensogram. Som sådan, apsikts kontroller må brukes til å eliminere falske positiver, og støtte fra komplementære tilnærminger er svært oppmerksom.

Figur 1 illustrerer utviklingen av en SPR eksperiment ved bruk av en NTA-belagt sensor chip. Den sensogram i panel A viser injeksjon av nikkelioner over NTA matrisen (unsubtracted data), og paneler BD vise dataene etter å subtrahere det signal som utledes fra den negative kontrollcellen. Rød og blå pilene viser injeksjon start og slutt, henholdsvis. Immobilisering av liganden på brikken gradvis forandrer massen før injeksjonen er avsluttet. Den stabile platå observert etter avslutning av ligand s injeksjon reflekterer stabil assosiasjon av liganden til overflaten (figur 1B, syklus 2). Når en stabil grunnlinje er oppnådd en buffer blir injisert i løpet av liganden og referansecellen (figur 1B, syklus 3) .Dette injeksjon tjener som en "blindprøve" og vil blitrekkes under analysen. Ved injeksjon, er mindre endringer registreres, noe som reflekterer en strømning av massen gjennom brikken. Så i en egen syklus (figur 1B, syklus 4), blir analytten injisert; den gradvise økning i RU representerer analytten tilknytning til liganden. Bindingssetene blir gradvis opptatt inntil likevekt er nådd. Så snart injeksjonen ender, en nedgang i jernbaneforetak reflekterer kompleksets dissosiasjon. Fra slike sensograms pre-likevekt og likevekts hastighetskonstanter kan avledes (se senere). Figur 1 viser en transient interaksjon mellom liganden og analytten. Når samspillet er mer stabil, er nedgangen i RU nivå tregere, noe som reflekterer en lavere k _d.

Heri, beskriver vi en SPR eksperiment som tar sikte på å karakterisere interaksjonen mellom en membran transportør (vaskemiddel oppløst) og dens funksjonelle partner, dens beslektede substrat bindende protein ^6,7. Den valgte model-systemet er en ATP bindende kassett (ABC) transporter, ModBC-A av Archeaglobus fulgidus. Dette systemet ble valgt for sin svært reproduserbare resultater, høy signal til støyforhold, og klassisk 'on / off "priser. I tillegg homologer ABC transportører er tilgjengelige for å tjene som viktige negative kontroller. Transportøren, ModBC (ligand A) ekstraheres fra membranen ved hjelp av vaskemiddel, renset og immobilisert på chipen. Sin løselig samspill partner, Moda, er analytten. Som en negativ kontroll-ligand, er en annen ABC-transportør RbsBC brukt ("ligand B").

Protocol

1. Protein Utvalg og Buffer Forberedelse Prøvepreparering: rense proteinene av interesse, og sørge for at alle aggregater er fjernet, ved injisering av proteinet før forsøket på en gel-filtreringskolonne eller ved ultrasentrifugering (vanligvis 10 minutter ved 100 000 xg er tilstrekkelig). MERK: Selv om ønskelig, svært rene proteinpreparater er ikke et must. SPR har blitt brukt med mindre enn perfekt renselser og selv med total ekstrakt 8,9. Buffer forberedelse: For…

Representative Results

I det system som her er beskrevet, er en NiNTA brikke brukes for å immobilisere His-tagget membran transportør 6,7. Å være en homo-dimer er hver transporter dobbelt merket, forbedre sin binding til NiNTA chip. Etter nikkel lasting, ligand A (den transportør av interesse) er immobilisert på Fc = 2, opp til ~ 3500 RU (protokoll syklus 2, Figur 2A black label). Deretter, ved bruk av samme injeksjonsstrøm og varighet, ligand B (kontroll-ligand) blir injisert på Fc = 1, først nådde bare …

Discussion

SPR er en svært følsom metode for å studere molekylære interaksjoner, og er ofte den eneste tilnærming som gir sanntids overvåking av forbigående (men viktige) interaksjoner. Et eksempel er transient interaksjon presentert heri, som ikke kunne påvises ved hvilken som helst annen metode (pull-down-analyser, liposomer sedimente assays ^6). Videre, mens andre fremgangsmåter er begrenset til likevekt målinger (enten kvantitativt eller kvalitativt), er SPR et av de få teknikker som måler også pre-likev…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01
Sensor Chip NTA	GE Healthcare	14100532
BIAevaluation	GE Healthcare
Biacore T200 Software	GE Healthcare
Nickel chloride	Sigma	N6136
Sodium tungstate dihydrate	Sigma	T2629
Sodium Chloride	Bio-Lab LTD.	19030591
Trizma base	Sigma	T1503
Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma	E5134
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM)	Affymetrix	D310
Sodium dodecyl sulfate solution	Sigma	05030
Kimwipes KIMTECH	Kimberly-Clark	34120
Hydrochloric acid	GADOT	7647-01-0
Nylon (NY) Membrane Filter	Sartorius	25007–47——N
ModBC ABC transporter	Lewinson lab
RbsBC ABC transporter	Lewinson lab
ModA Substrate Binding Protein	Lewinson lab