Måling rumlige og tidslige Ca²⁺ Signaler i Arabidopsis Planter

Summary

Ca ^{2 +-signalering} regulerer forskellige biologiske processer i planter. Her præsenterer vi tilgange til overvågning af abiotisk stress induceret rumlige og tidslige Ca ^{2 +-signaler} i Arabidopsis celler og væv ved hjælp af genetisk indkodede Ca ^{2 +} indikatorer aequorin eller Case12.

Abstract

Developmental og miljømæssige signaler inducerer Ca ^{2 +} udsving i planteceller. Stimulus-specifikke rumlige-temporale Ca ^{2 +} mønstre sanses af cellulære Ca ^{2 +-bindende} proteiner, der initierer Ca ^{2 +} signaleringskaskader. Men vi stadig ved meget lidt om, hvordan stimulus specifik Ca2 ⁺ signaler genereres. Specificiteten af en Ca ^{2 +-signal} kan tilskrives den sofistikerede regulering af aktiviteterne i Ca ^{2 +} kanaler og / eller transportvirksomheder som reaktion på en given stimulus. At identificere disse cellulære komponenter og forstå deres funktioner, er det afgørende at anvende systemer, der tillader en følsom og robust optagelse af Ca ^{2 +-signaler} på både væv og cellulære niveauer. Genetisk indkodede Ca ^{2 +} indikatorer, der er målrettet til forskellige cellulære rum har givet en platform for levende celle konfokal billeddannelse af cellulære Ca ^{2 +-signaler.} Her beskriver vi instruktions for anvendelsen af to Ca ^{2 +} detektionssystemer: aequorin baserede FAS (film selvklæbende frøplanter) luminescens Ca ^{2 +} billedbehandling og case12 baseret levende celler konfokal fluorescens Ca ^{2 +} billeddannelse. Luminescensdatering billeddannelse ved hjælp af FAS-systemet giver en enkel, robust og følsom påvisning af rumlige og tidslige Ca ^{2 +} signaler på vævet niveau, mens levende celler konfokal billeddannelse ved hjælp Case12 giver samtidig påvisning af cytosol og nukleare Ca ^{2 +-signaler} i en høj opløsning.

Introduction

Plantecellen reagerer til miljøet via signalering, som koordinerer cellehandlinger. En tidlig cellesignalerende begivenhed i respons på stimuli af miljøet er en forbigående Ca2 ⁺ stigning. Mønstret eller underskrift af en forbigående stigning i fri Ca2 ^{+-koncentration} er kendetegnet ved sin amplitude, frekvens og varighed. Tydelige spatio-temporale Ca ^{2 +} signaturer regulerer forskellige cellulære aktiviteter ^1. Specifikke stimuli, såsom varme, kulde, salt, tørke, lys eller plante hormoner, kan finjustere spatio-temporale aktivitet af membran-lokaliserede Ca ^{2 +} kanaler og / eller transportvirksomheder, hvilket resulterer i specifikke Ca ^{2 +} underskrifter. Selvom Ca ^{2 +} transportører er blevet godt karakteriseret, er lidt om de molekylære identiteter og funktioner af Ca ^{2 +} kanaler i planter ^1. Genetiske skærme for mutanter med ændret Ca2 ⁺ reaktion på stress stimuli kan være en effektiv ca.oach til at identificere de komponenter, der udgør Ca ^{2 +} signaturer. For nylig flere aequorin baserede Ca ^{2 +} detection systemer er blevet udviklet, der letter genetiske skærme for Ca ^{2 +} signalering komponenter som reaktion på patogen angreb og abiotisk stress ^2-4.

Aequorin blev første gang brugt til at detektere Ca ^{2 +-signaler} i planter i begyndelsen af 1990'erne ^5. Siden da har aequorin blevet målrettet til forskellige cellulære rum, såsom cytoplasmaet ⁵ kerne ^6, chloroplaster ^7, tonoplast ⁸ mitokondrier ⁹ og stroma ^10, såvel som til forskellige celletyper i roden at overvåge cellespecifik Ca ^{2 +} signaler ^11. Aequorin baserede ^{Ca2 +} målinger afslører den rumlige og tidsmæssige Ca ^{2 +} svar af en population af celler til at understrege stimuli. Men i de fleste tilfælde Ca2 ⁺ reaktioner enkeltceller er unsynchroniZed i reagerer væv ^4. Derfor er aequorin Ca2 ⁺ optagelse ikke nødvendigvis rapportere Ca ^{2 +-signalet} i de enkelte celler. I de seneste år er genetisk kodet fluorescerende protein (FP) -baseret Ca2 ⁺ indikatorer, såsom gul cameleon (ycs) ¹² og CASEs12 ¹³ er blevet brugt til at studere Ca ^{2 +-signalering} høj subcellulær opløsning. YCS er fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) -baseret Ca ^{2 +} indikatorer, som indeholder den fælles fiskeripolitik og YFP varianter forbundet af Ca ^{2 +} -bindende protein calmodulin og calmodulin-bindende peptid M13. Calmodulin undergår en konformationsændring da det binder sig til Ca ^{2 +,} hvilket bringer den fælles fiskeripolitik og YFP tættere sammen, hvilket resulterer i øget energioverførsel (forstærket FRET). Niveauet FRET over tid, beregnes omtrent som forholdet mellem YFP til FFP signalintensiteter afspejler intracellulær Ca2 ⁺ dynamik. Adskillige YC versioner er blevet anvendt i planter. YC3.6 var targeted til cytosolen ^14,15, kerne ^16, mitokondrier ^17, og plasmamembranen ¹⁸ og YC4.6 og D4ER var rettet til skadestuen ^15,19, og D3cpv var målrettet til de peroxisomer ^20. Transgene planter, der udtrykker ycs tillader live-cell imaging af Ca ^{2 +} dynamik inden for forskellige cellulære rum i forskellige celletyper. Sager (formodentlig Ca lcium selv nsor) er enkelt cirkulært permuteret fluorescerende proteiner (cpFPs) indeholdende et calmodulin og calmodulin-bindende peptid M13. Ved binding til Ca2 ^+, tilfælde undergår konformationsændringer, hvilket fører til en forøgelse af fluorescens intensitet. Korrelationen mellem taskens fluorescens respons og Ca ^{2 +} koncentration tillader intracellulær Ca ^{2 +} dynamik, der skal måles kvantitativt. Den Case12 variant har 12 gange øget fluorescens i Ca2 ⁺ Mættede former. N. benthiminana planter transient EXPREssing Case12 eller Arabidopsis planter stabilt udtrykker sag 12 blev brugt til at studere Ca ^{2 +} signalering i forsvar og abiotisk stress ^4,21. Asynkron rumlige og tidslige Ca ^{2 +} svingninger i celler reagerer på patogen angreb, eller dehydrering stress er blevet afsløret med Case12 baserede Ca ^{2 +} billeddannelse.

Her præsenterer vi detaljerede instruktioner til aequorin baseret luminescens billeddannelse af vævs- og stimuli specifik Ca ^{2 +} dynamik i Arabidopsis kimplanter, og konfokal billeddannelse af cytosol og nuklear Ca ^{2 +} dynamik i Arabidopsis rod celler, der udtrykker sag 12. Luminescence billeddannelse af FAS kan tilpasses til at analysere stress-induceret Ca2 ⁺ dynamik i intakte planter eller væv ikke er beskrevet her, eller til at screene mutageniserede Arabidopsis plante populationer mutanter med ændret stress induceret Ca2 ^+-signaler. Den levende celle Ca ^{2 +} imaging setup kunne tilpasses til at analysere Ca2 + dynamik inden for forskellige subcelluar rum eller i forskellige celletyper ved hjælp af andre Ca ^{2 +} indikatorer.

Protocol

1. aequorin Based Ca 2 + Imaging Brug FAS systemet Forbered stiklinger til luminescens billeddannelse. Steriliser frø af Arabidopsis planter udtrykker aequorin med 10% blegemiddel indeholdende 0,01% Triton-100. Sår sterile frø på en kvadratisk plade (10 x 10 cm kvadrat petriskål med gitter) indeholdende fuld styrke MS (Murashige og Skoog Basal Salt Blanding), 1% saccharose og 1,2% agar. Placer pladerne lodret i en vækst kammer efter stratificering ved 4 ° C i 2 dage (figur 1A).</stro…

Representative Results

Mannitol, NaCl og H 2 O 2 blev anvendt som stedfortrædere for dehydrering, salt og oxidativt stress stimuli hhv. For at kontrollere om tungmetalion Cu2 + synergizes med nogen af disse tre stress stimuli, vi sammenlignede Ca2 + reaktionerne på hver stimuli i nærvær eller fravær af Cu2 +. Som vist i figur 2, afslørede FAS luminescens billeddannelse at Arabidoposis kimplanter reagerede forskelligt på dehydrering, salt og oxidativt stress. For ko…

Discussion

Vi har vist et FAS system til registrering af den rumlige-temporale Ca ^{2 +} svar fra Arabidopsis frøplanter. Dette FAS Ca2 ⁺ optagelse system giver en simpel, følsom og robust fremgangsmåde, der kan tilpasses til måling af Ca2 ⁺ dynamik udløst af forskellige stimuli foruden de abiotisk stress stimuli, der er præsenteret her. Ved hjælp af dette system, kan vi nemt sammenligne vævs- eller stimuli-specifikke rumlige-tidsmæssige Ca ^{2 +} dynamik på helplanteniveau. Den høj…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
10X10 cm square petri dish	VWR	60872-310
adhesive film	VWR	60941-062
polyethylene tubing	PerkinElmer	9908265
1 mL syringe	VWR	53548-000
silicone grease	Beckman	335148
2-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155379
8-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155409
luminescence imaging system	Princeton Instruments	N/A
inverted confocal laser-scanning microscope	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon A1R
Imaging software	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon Elements
ImageJ	NIH	N/A	Public domain, Java-based image processing program
DataGraph	Visual Data Tools Inc	N/A	DataGraph 3.1.1 is the newest version
coelenterazine	NanoLight Technolgies	#301B NF-BCTZ-FB
All purpose Bleach	Any local store	N/A
Triton X-100	Fisher	BP151500
MS salt	Phytotechnology Labs	M524-50L
sucrose	VWR	BDH8029-12KG
Agar	Sigma	A1296-5KG
Phytagel	Sigma	P8169-1KG