מדידת מרחב ובזמן Ca^{2 +} אותות בצמחים ארבידופסיס

Summary

איתות ^{2 +} Ca מסדירה תהליכים ביולוגיים מגוונים בצמחים. כאן אנו מציגים גישות לניטור לחץ אביוטי המושרה Ca מרחב ובזמן ^{2 +} אותות בתאי ארבידופסיס ורקמות באמצעות Ca ^{2 +} אינדיקטורים מקודד גנטי Aequorin או Case12.

Abstract

רמזים התפתחותית וסביבתיים לגרום Ca ^{2 +} תנודות בתאי צמח. Ca ^{2 +} דפוסי מרחב וזמן גירוי ספציפי חשו על ידי חלבוני Ca ^{2 +} מחייב סלולריים שליזום Ca ^{2 +} מפלי איתות. עם זאת, אנחנו עדיין יודעים מעט על איך גירוי האותות ^{2 +} Ca הספציפי נוצרים. הספציפיות של אות Ca ^{2 +} ניתן לייחס לרגולציה המתוחכמת של הפעילויות של הערוצים ו / או מובילי Ca ^{2 +} בתגובה לגירוי נתון. לזהות מרכיבים תאיים אלה ולהבין את תפקידם, זה קריטי לשימוש במערכות המאפשרות הקלטה רגישה וחזקה של אותות ^{2 +} Ca בשתי הרקמות ורמות תאיות. Ca ^{2 +} אינדיקטורים מקודד גנטי שממוקדות לתאים סלולריים שונים סיפקו פלטפורמה להדמית confocal תא חי של Ca ^{2 +} אותות סלולריים. כאן אנו מתארים הוראהים לשימושם של שני Ca ^{2 +} מערכות גילוי: aequorin FAS (שתילי דבק סרט) הדמיה הארה Ca ^{2 +} וcase12 הקרינה confocal תא חי המבוססת הדמיה Ca ^{2 +} מבוסס. הדמיה הארה באמצעות מערכת FAS מספקת זיהוי פשוט, חזק ורגיש של ^{2 +} אותות מרחב ובזמן Ca ברמת הרקמה, תוך הדמיה confocal תא חי באמצעות Case12 מספקת זיהוי בו זמני של cytosolic ^{ו2 +} אותות Ca גרעיניים ברזולוציה גבוהה.

Introduction

תא הצמח מגיב לסביבה באמצעות איתות שהוא מתאם את פעולות תא. תא מוקדם איתות אירוע בתגובה לגירויים סביבתיים הוא עליית Ca ^{2 +} ארעית. הדפוס, או החתימה של עלייה זמנית בריכוז Ca ^{2 +} חינם מאופיין במשרעת, התדירות, ומשך הזמן שלה. חתימות ^{2 +} Ca מרחב ובזמן שונים מסדירות את הפעילות סלולרית שונה ^1. גירויים ספציפיים, כגון חום, קור, מלח, הבצורת, אור, או הורמונים צמחיים, עשויים לכוונן את פעילות מרחב ובזמן של ערוצים מקומי קרום Ca ^{2 +} ו / או מובילים, וכתוצאה מכך Ca ^{2 +} חתימות ספציפיות. למרות Ca ^{2 +} מובילים כבר מאופיינים היטב, מעט מאוד ידוע על הזהות המולקולרית ופונקציות של ערוצי ^{2 +} Ca בצמחי ^1. מסכי גנטיים למוטציות בתגובה שינתה Ca ^{2 +} להדגיש גירויים עשויים להיות appr יעילאוח לזיהוי הרכיבים שמרכיבים את חתימות Ca ^{2 +.} מערכות גילוי Ca ^{2 +} לאחרונה מבוססים כמה Aequorin פותחו המאפשרות מסכי גנטיים לCa ^{2 +} איתות רכיבים בתגובה להתקפת הפתוגן ואביוטי מתח ^2-4.

Aequorin שימש לראשונה כדי לזהות Ca ^{2 +} אותות בצמחים בתחילת 1990 ^5. מאז, Aequorin כבר ממוקד לתאים סלולריים שונים, כגון ציטופלסמה ^5, גרעין ^6, כלורופלסטים ^7, tonoplast ^8, מיטוכונדריה ^9, וסטרומה ^10, כמו גם לסוגים שונים של תאים בשורש כדי לפקח על תא ספציפי Ca ^{2 +} אותות ^11. מדידות Ca ^{2 +} מבוסס Aequorin לחשוף את Ca ^{2 +} תגובת מרחב ובזמן של אוכלוסייה של תאים להדגיש גירויים. עם זאת, ברוב המקרים, תגובות Ca ^{2 +} של תאים בודדים הן unsynchronized ברקמות להגיב ^4. לכן, הקלטת ^{2 +} Aequorin Ca לא בהכרח לדווח אות Ca ^{2 +} בתאים בודדים. בשנים האחרונות, חלבון פלואורסצנטי מקודד גנטי (FP) המבוסס Ca ^{2 +} אינדיקטורים, כגון Cameleon הצהוב (YCS) ^{12 ו13} CASEs12 היה בשימוש ללמוד Ca ^{2 +} איתות עם רזולוציה subcellular גבוהה. YCS הוא העברת אנרגיית תהודת הקרינה (סריג) המבוסס Ca ^{2 +} אינדיקטורים, המכילה CFP ו YFP ריאנטים מקושר על ידי Ca ^{2 +} -binding calmodulin החלבון ופפטיד מחייב calmodulin M13. Calmodulin עובר שינוי קונפורמציה כפי שהוא נקשר לCa ^{2 +,} ובכך מביא CFP ו YFP ביחד קרוב, וכתוצאה מכך העברת אנרגיה מוגברת (סריג משופר). רמת סריג לאורך זמן, מחושבת בערך כמו היחס של YFP לעוצמות אות CFP, משקפת תאיים Ca ^{2 +} דינמיקה. כמה גרסאות י"ס היו בשימוש בצמחים. YC3.6 היה targeted לcytosol ^14,15, גרעין ^16, מיטוכונדריה ^17, וקרום פלזמה ^18, וYC4.6 וD4ER היו ממוקד לחדר המיון ^15,19, וD3cpv היה ממוקד peroxisomes ^20. צמחים מהונדסים מבטא YCS לאפשר ההדמיה לחיות התאים של Ca ^{2 +} דינמיקה בתוך תאים סלולריים שונים של סוגי תאים שונים. מקרים (כנראה Ca lcium se nsor) הם חלבונים יחידים מעגלי permuted ניאון (cpFPs) מחסה calmodulin ופפטיד מחייב calmodulin M13. על הכריכה לCa ^{2 +,} מקרים עוברים שינויי קונפורמציה, שהובילו לגידול של עוצמת הקרינה. המתאם בין תגובת הקרינה של CASE וריכוז Ca ^{2 + 2 +} מאפשר דינמיקה תאית Ca להימדד כמותית. גרסת Case12 יש לקפל 12 עלתה הקרינה בCa ^{2 +} צורות -saturated. נ צמחי benthiminana זמני exprEssing Case12 או צמחי ארבידופסיס ביציבות להביע 12 מקרה שמשו ללמוד איתות Ca ^{2 +} במתח הבטחוני ואביוטי ^{4,21. 2 +} תנודות Ca מרחב ובזמן אסינכרוני בתאים מגיבים להתקפת הפתוגן, או ללחץ התייבשות נחשפו עם ההדמיה Ca ^{2 +} מבוסס Case12.

כאן, אנו מציגים הוראות מפורטות להדמית Aequorin מבוססת הארה של ברקמה וגירויים ספציפית Ca ^{2 +} דינמיקה בשתילי ארבידופסיס, והדמית confocal של cytosolic וCa הגרעיני ^{2 +} דינמיקה בתאי שורש ארבידופסיס המבטאות מקרה 12. הדמיה הארה של FAS יכול להיות מותאם כדי לנתח דינמיקת Ca ^{2 +} מתח מושרה בצמחים או ברקמות אינן מתוארות כאן בשלמותה, או כדי לסנן אוכלוסיות צמח ארבידופסיס mutagenized למוטציות עם לחץ שינה המושרה Ca ^{2 +} אותות. התקנת ההדמיה התא החי Ca ^{2 +} יכולה להיות מותאמת כדי לנתח Ca2 + דינמיקה בתוך תאי subcelluar שונים או בתאים מסוגים שונים באמצעות Ca ^{2 +} אינדיקטורים אחרים.

Protocol

.1 ההדמיה Aequorin מבוסס Ca 2 + שימוש במערכת FAS הכן שתילי הדמיה הארה. לעקר זרעים של צמחי ארבידופסיס להביע Aequorin עם פתרון אקונומיקה 10% מכיל 0.01% Triton-100. לזרוע את הזרעים סטריליים על צלחת מרובעת (10 x 10 סנטימטר צלחת פטרי מרובע עם ?…

Representative Results

מניטול, NaCl וH 2 O 2 שמשו כשליחים לגירויי התייבשות, מלח וסטרס חמצונים, בהתאמה. כדי לבדוק אם יון המתכת הכבד Cu 2 + synergizes עם כל אחד משלושת גירויי מתח אלה, השווינו את תגובת Ca 2 + לכל גירויים בנוכחותו או היעדריו של Cu 2 +. כפי שניתן לראות באיור 2, …

Discussion

אנחנו הוכחנו מערכת FAS להקלטת Ca ^{2 +} תגובת מרחב וזמן של שתילי ארבידופסיס. מערכת הקלטה זו FAS Ca ^{2 +} מספקת גישה פשוטה, רגישה וחזקה שיכול להיות מותאמת למדידת Ca ^{2 +} דינמיקה מופעלת על ידי גירויים שונים, בנוסף לגירויים אביוטי המתח שמוצגים כאן. באמצעות מערכת זו, אנו …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
10X10 cm square petri dish	VWR	60872-310
adhesive film	VWR	60941-062
polyethylene tubing	PerkinElmer	9908265
1 mL syringe	VWR	53548-000
silicone grease	Beckman	335148
2-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155379
8-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155409
luminescence imaging system	Princeton Instruments	N/A
inverted confocal laser-scanning microscope	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon A1R
Imaging software	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon Elements
ImageJ	NIH	N/A	Public domain, Java-based image processing program
DataGraph	Visual Data Tools Inc	N/A	DataGraph 3.1.1 is the newest version
coelenterazine	NanoLight Technolgies	#301B NF-BCTZ-FB
All purpose Bleach	Any local store	N/A
Triton X-100	Fisher	BP151500
MS salt	Phytotechnology Labs	M524-50L
sucrose	VWR	BDH8029-12KG
Agar	Sigma	A1296-5KG
Phytagel	Sigma	P8169-1KG