Misurazione spaziale e temporale Ca^{2 +} Segnali in Arabidopsis Piante

Summary

Segnalazione Ca ^{2 +} regola diversi processi biologici nelle piante. Qui vi presentiamo approcci per il monitoraggio di stress abiotico indotto Ca spaziale e temporale ²⁺ segnali nelle cellule e tessuti utilizzando le geneticamente codificati Ca ^{2 +} indicatori aequorina o Case12 Arabidopsis.

Abstract

Spunti di sviluppo e ambientali inducono Ca ^{2 +} fluttuazioni di cellule vegetali. Specifica-Stimolo spazio-temporali Ca ^{2 +} modelli vengono rilevati da Ca ^{2 +} legame proteine ​​cellulari che avviano Ca cascate di segnalazione ^{2 +.} Tuttavia, sappiamo ancora poco su come i segnali di stimolo specifico Ca ^{2 +} sono generati. La specificità di un segnale Ca ^{2 +} può essere attribuito al sofisticato regolamentazione delle attività di Ca ^{2 +} canali e / o trasportatori in risposta ad un dato stimolo. Per identificare questi componenti cellulari e capire le loro funzioni, è fondamentale utilizzare sistemi che permettono una registrazione sensibile e robusto di segnali Ca2 ⁺ sia a livello tissutale e cellulare. Geneticamente codificati Ca ^{2 +} indicatori che sono indirizzate ai vari compartimenti cellulari hanno fornito una piattaforma per cellule in vivo confocale di cellulari Ca ^{2 +} segnali. Qui si descrive l'istruziones per l'utilizzo di due sistemi di rilevamento Ca ^{2 +:} aequorina basa FAS (film piantine adesivi) luminescenza Ca ^{2 +} di imaging e case12 a base di cellule dal vivo confocale Ca ^{2 +} imaging. Di imaging luminescenza utilizzando il sistema FAS fornisce un rilevamento semplice, robusta e sensibile spaziali e temporali Ca ^{2 +} segnali a livello dei tessuti, mentre cellule vive di imaging confocale utilizzando Case12 fornisce rilevamento simultaneo di citosoliche e nucleari Ca ^{2 +} segnali ad alta risoluzione.

Introduction

La cellula vegetale risponde all'ambiente via di segnalazione che coordina le azioni delle cellule. Una cella all'inizio di segnalazione evento in risposta a stimoli ambientali è un transitorio aumento di Ca ^{2 +.} Il modello, o la firma di un aumento transitorio della concentrazione di Ca ^{2 +} libero si caratterizza per la sua ampiezza, frequenza e durata. Firme Ca ^{2 +} spazio-temporali distinti regolano diverse attività cellulari ^1. Stimoli specifici, come il caldo, il freddo, il sale, la siccità, la luce, o ormoni vegetali, possono ottimizzare l'attività spazio-temporale della membrana localizzata Ca ^{2 +} canali e / o trasportatori, con conseguente specifici Ca ^{2 +} firme. Sebbene Ca ^{2 +} trasportatori sono stati ben caratterizzati, poco si sa circa l'identità molecolare e le funzioni dei canali del Ca ^{2 +} nelle piante ^1. Schermi genetici per mutanti con alterata Ca ^{2 +} risposta allo stress stimoli possono essere un efficace approach per identificare i componenti che compongono Ca ^{2 +} firme. Sistemi di rilevamento Ca ^{2 +} Recentemente fonda diversi aequorina sono stati sviluppati che facilitano schermi genetici per Ca ^{2 +} componenti di segnalamento in risposta agli attacchi patogeni e stress abiotici ^2-4.

Aequorina è stato utilizzato prima per rilevare Ca ^{2 +} segnali nelle piante nei primi anni 1990 ^5. Da allora, equorina è stata mirata ai vari compartimenti cellulari, come il citoplasma ^5, nucleo ^{6, 7} cloroplasti, tonoplasto ^{8, 9} mitocondri, stroma e ^10, nonché di differenti tipi cellulari nella radice di monitorare cella specifica Ca ^{2 +} segnali ^11. Ca ^{2 +} base aequorina misurazioni rivelano l'spaziale e temporale Ca ^{2 +} risposta di una popolazione di cellule allo stress stimoli. Tuttavia, nella maggior parte dei casi, il Ca ^{2 +} risposte di cellule singole sono unsynchronized nel tessuto risposta ^4. Pertanto, la registrazione aequorina Ca ^{2 +} non necessariamente riporta il segnale Ca ^{2 +} in celle singole. Negli ultimi anni, proteina fluorescente geneticamente codificato (FP) a base di Ca ^{2 +} indicatori, come cameleon giallo (YCS) ¹² e CASEs12 ¹³ sono stati utilizzati per studiare Ca ^{2 +} di segnalazione ad alta risoluzione subcellulare. YCS sono fluorescenza trasferimento di energia di risonanza (FRET) a base di Ca ^{2 +} indicatori, contenente PCP e YFP varianti aggiunto dal Ca ^{2 +} -binding proteina calmodulina e-calmodulina legame peptide M13. Calmodulina subisce un cambiamento conformazionale in quanto si lega al Ca ^{2 +,} quindi porta la PCP e YFP più vicini, con conseguente aumento del trasferimento di energia (maggiore FRET). Il livello di FRET nel corso del tempo, calcolato approssimativamente come il rapporto tra YFP per intensità di segnale della PCP, riflette intracellulare Ca ^{2 +} dinamica. Diverse versioni YC sono stati utilizzati negli impianti. YC3.6 era targeted al citosol ^{14,15, 16} nucleo, mitocondri ^17, e la membrana plasmatica ^18, e YC4.6 e D4ER sono stati mirati al pronto soccorso ^15,19, e D3cpv è stato destinato ai perossisomi ^20. Le piante transgeniche esprimenti YCS consentono al live-cell imaging di Ca ^{2 +} dinamiche all'interno di diversi compartimenti cellulari di diversi tipi di cellule. Casi (presumibilmente Ca lcium se nsor) sono singole proteine ​​circolarmente permutati fluorescenti (cpFPs) ospitano una calmodulina e-calmodulina legame peptide M13. Al legame con Ca ^{2 +,} casi subiscono cambiamenti conformazionali, portando ad un aumento di intensità di fluorescenza. La correlazione tra la risposta di fluorescenza del CASE e Ca ^{2 +} permette la concentrazione intracellulare di Ca ^{2 +} dinamiche da misurare quantitativamente. La variante Case12 è 12 volte maggiore fluorescenza nelle Ca ^{2 +} forme -saturated. N. piante benthiminana transitoriamente expressing Case12 o piante di Arabidopsis che esprimono stabilmente involucro 12 sono stati utilizzati per studiare Ca ^{2 +} Segnalazione di difesa e lo stress abiotici ^4,21. Asincrono Ca spaziale e temporale ²⁺ oscillazioni nelle cellule rispondono agli attacchi patogeni, o per lo stress disidratazione sono stati rivelati con base Case12 Ca ^{2 +} imaging.

Qui, vi presentiamo le istruzioni dettagliate per aequorina basato luminescenza imaging tessuto- e stimoli specifici Ca ^{2 +} dinamiche di piantine di Arabidopsis, e per l'imaging confocale di citosolico e nucleare Ca ^{2 +} dinamiche nelle cellule della radice di Arabidopsis che esprimono, causa 12 Luminescence imaging FAS potrebbe essere adattato per l'analisi di stress-indotta Ca ^{2 +} dinamiche in impianti o tessuti qui non descritti intatti, o per lo screening popolazioni di piante di Arabidopsis mutagenizzate per mutanti con alterata dello stress indotto Ca ^{2 +} segnali. La configurazione Imaging Ca ^{2 +} cellule vive potrebbe essere adattato per analizzare Ca2+ dinamiche all'interno diversi scomparti subcelluar o in diversi tipi di cellule utilizzando altri indicatori di Ca ^{2 +.}

Protocol

1 aequorina Based Imaging Ca 2 + Uso del sistema FAS Preparare piantine per l'imaging luminescenza. Sterilizzare semi di piante di Arabidopsis esprimenti aequorina con una soluzione di candeggina al 10% contenente 0,01% Triton-100. Seminare i semi sterili su un piatto quadrato (10 x 10 centimetri piatto quadrato Petri con griglia,) contenenti piena forza MS (Murashige e Skoog basale Sale Miscela), 1% di saccarosio, e il 1,2% agar. Piastre Inserire verticalmente in una camera di crescita dopo st…

Representative Results

Mannitolo, NaCl e H 2 O 2 sono stati utilizzati come proxy per gli stimoli disidratazione, il sale e lo stress ossidativo, rispettivamente. Per controllare se lo ione metallo pesante Cu 2 + sinergia con qualsiasi di questi tre stimoli di stress, abbiamo confrontato il Ca 2 + risposta ad ogni stimolo in presenza o assenza di Cu 2 +. Come mostrato in Figura 2, FAS di imaging luminescenza rivelato che piantine Arabidoposis risposto diversamente a disid…

Discussion

Abbiamo dimostrato un sistema FAS per la registrazione del spazio-temporale Ca ^{2 +} risposta di piantine di Arabidopsis. Questo ²⁺ sistema di registrazione FAS Ca offre un approccio semplice, sensibile e robusto che può essere adattato per misurare Ca ^{2 +} dinamiche innescate da vari stimoli, oltre agli stimoli di stress abiotici che vengono presentati qui. Utilizzando questo sistema, siamo in grado di confrontare facilmente tessutale o stimoli specifici spazio-temporali Ca ^{2 +}…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
10X10 cm square petri dish	VWR	60872-310
adhesive film	VWR	60941-062
polyethylene tubing	PerkinElmer	9908265
1 mL syringe	VWR	53548-000
silicone grease	Beckman	335148
2-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155379
8-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155409
luminescence imaging system	Princeton Instruments	N/A
inverted confocal laser-scanning microscope	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon A1R
Imaging software	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon Elements
ImageJ	NIH	N/A	Public domain, Java-based image processing program
DataGraph	Visual Data Tools Inc	N/A	DataGraph 3.1.1 is the newest version
coelenterazine	NanoLight Technolgies	#301B NF-BCTZ-FB
All purpose Bleach	Any local store	N/A
Triton X-100	Fisher	BP151500
MS salt	Phytotechnology Labs	M524-50L
sucrose	VWR	BDH8029-12KG
Agar	Sigma	A1296-5KG
Phytagel	Sigma	P8169-1KG