Mesure spatiale et temporelle Ca^{2 +} Signaux de plantes d'Arabidopsis

Summary

^Ca la signalisation régule divers processus biologiques dans les plantes. Ici, nous présentons des approches pour le suivi du stress abiotique induit Ca ^{2 +} spatiale et temporelle des signaux dans les cellules et les tissus en utilisant les codés génétiquement ^{Ca2 +} indicateurs Aequorin ou cas12 Arabidopsis.

Abstract

Les indices de développement de l'environnement et induisent des fluctuations de ^{Ca2 +} dans les cellules végétales. spatio-temporelles de ^{Ca2 +} modèles spécifiques de stimulation sont détectées par cellulaires Ca2 ⁺ protéines de liaison qui initient ^{Ca2 +} cascades de signalisation. Cependant, nous en savons encore peu de choses sur la façon dont les signaux ^de stimulus Ca spécifique sont générés. La spécificité d'un signal de Ca2 ⁺ peut être attribuée à la régulation sophistiquées de l'activité des canaux et / ou des transporteurs ^de Ca en réponse à un stimulus donné. Pour identifier ces composants cellulaires et comprendre leurs fonctions, il est essentiel d'utiliser des systèmes qui permettent un enregistrement sensible et robuste des signaux ^de Ca à la fois le tissu et niveaux cellulaires. Codés génétiquement ^{Ca2 +} indicateurs qui ciblent différents compartiments cellulaires ont fourni une plate-forme pour des cellules vivantes imagerie confocale de cellulaires ^{Ca2 +} signaux. Nous décrivons ici l'instructions pour l'utilisation de deux systèmes de ^{Ca2 +} de détection: aequorine base (FAS adhésives Les plants de film luminescence) Ca2 ⁺ et d'imagerie des cellules vivantes cas12 fluorescence confocal basé imagerie de Ca2 ^+. imagerie de luminescence en utilisant le système FAS fournit une détection simple, robuste et sensible spatiales et temporelles des signaux Ca2 ⁺ au niveau des tissus, tandis que la cellule en direct imagerie confocale en utilisant cas12 permet la détection simultanée de cytosolique de Ca2 ⁺ et signaux nucléaires à haute résolution.

Introduction

La cellule de plante répond à l'environnement par l'intermédiaire d'une signalisation qui coordonne les actions cellulaires. Événement de signalisation en réponse à des stimuli de l'environnement d'une cellule début est une augmentation transitoire de Ca2 ^+. Le modèle, ou la signature d'une augmentation transitoire de la concentration de Ca2 ⁺ libre est caractérisé par son amplitude, la fréquence et la durée. Signatures Ca2 ⁺ spatio-temporelles distinctes régissent différentes activités cellulaires ^1. Stimuli spécifiques, tels que la chaleur, le froid, le sel, la sécheresse, la lumière, ou des hormones végétales, peuvent affiner l'activité spatio-temporelle de la membrane localisée canaux ^{Ca2 +} et / ou transporteurs, entraînant spécifiques ^{Ca2 +} signatures. Bien que ^{Ca2 +} transporteurs ont été bien caractérisés, on sait peu sur l'identité et les fonctions moléculaires des canaux ^de Ca dans les plantes ^1. Écrans génétiques pour les mutants avec altéré Ca2 ⁺ réponse au stress stimuli peuvent être une appr efficaceOach pour identifier les composants qui composent Ca ^de signatures. ^{Ca2 +} systèmes de détection récemment fondé plusieurs Aequorin ont été développés qui facilitent écrans génétiques pour Ca2 ⁺ composants de signalisation en réponse à l'attaque d'agents pathogènes et stress abiotique ^2-4.

A été utilisé pour la première Aequorin pour détecter des signaux ^{Ca2 +} dans les usines dans les années 1990 ^5. Depuis lors, l'aequorine a été ciblée pour différents compartiments cellulaires, tels que le cytoplasme ^5, le noyau ^6, les chloroplastes ^7, tonoplastique ^8, les mitochondries ^9, et le stroma ^10, ainsi que de différents types de cellules dans la racine de surveiller cellule spécifique Ca ^{2 + 11} signaux. Les mesures sur la base de Ca ^de l'aequorine révèlent le Ca2 ⁺ réponse spatiale et temporelle d'une population de cellules pour souligner stimuli. Cependant, dans la plupart des cas, les réponses ^du Ca de cellules individuelles sont unsynchronized dans le tissu de répondre ^4. Par conséquent, l'enregistrement ^de Aequorin Ca ne rend pas nécessairement le signal Ca2 ⁺ dans des cellules individuelles. Au cours des dernières années, la protéine fluorescente génétiquement codé (FP) à base de ^{Ca2 +} indicateurs, tels que cameleon jaune (centres jeunesse) ¹² et ¹³ cas12 ont été utilisés pour étudier la signalisation Ca2 ⁺ avec une résolution subcellulaire élevé. Centres jeunesse sont le transfert d'énergie de fluorescence par résonance (FRET) à base d'indicateurs de ^{Ca2 +,} contenant CFP et YFP variants lié par le liant le Ca2 ⁺ et calmoduline de la protéine de peptide liant la calmoduline M13. Calmodulin subit un changement de conformation telle qu'elle se lie au Ca2 ^+, ce qui apporte CFP et YFP rapprocher, ce qui entraîne un transfert d'énergie accrue (FRET accru). Le niveau de FRET avec le temps, plus ou moins calculé comme le rapport de la YFP à la PCP intensités de signal, traduit la dynamique intracellulaire de ^{Ca2 +.} Plusieurs versions YC ont été utilisés dans des plantes. YC3.6 était targeted vers le cytosol ^{14,15, 16} noyau, les mitochondries ^17, et la membrane plasmique ^18, et YC4.6 et D4ER ont été ciblés à l'urgence ^15,19, et D3cpv a été visé aux peroxysomes ^20. Les plantes transgéniques exprimant des centres jeunesse permettent l'imagerie des cellules vivantes de Ca2 ⁺ dynamique au sein de différents compartiments cellulaires de différents types de cellules. Cas (probablement Ca lcium soi RNDS) sont des protéines simples circulairement permutées fluorescentes (cpFPs) abritant une calmoduline et le peptide liant la calmoduline M13. Lors de la liaison à Ca2 ^+, les cas sont soumis à des changements de conformation, conduisant à une augmentation de l'intensité de fluorescence. La corrélation entre la réponse de fluorescence de la CAS et concentration de Ca2 ⁺ intracellulaire de Ca2 ⁺ permet dynamique à mesurer quantitativement. La variante cas12 a 12 fois fluorescence accrue dans les ^{Ca2 +} formes saturés. N. plantes benthiminana transitoire expresser cas12 ou de plantes d'Arabidopsis exprimant de façon stable Case 12 ont été utilisés pour étudier la signalisation Ca2 ⁺ dans la défense et stress abiotique ^4,21. Asynchrone spatiale et temporelle Ca2 ⁺ oscillations dans les cellules répondant à une attaque pathogène, ou au stress de déshydratation ont été révélés avec la société cas12 Ca2 ⁺ imagerie.

Ici, nous présentons des instructions détaillées pour Aequorin imagerie de luminescence en fonction de stimuli et tissulaire spécifique ^{Ca2 +} dynamique en plants d'Arabidopsis, et pour l'imagerie confocale de cytosolique et nucléaire Ca ^{2 +} dynamique dans les cellules d'Arabidopsis profondes qui expriment Cas 12: Luminescence imagerie du SAF pourrait être adapté pour analyser le stress induit par ^{Ca2 +} dynamique dans les plantes ou les tissus ne sont pas décrits ici intacts, ou pour dépister les populations de plantes d'Arabidopsis mutagénisées des mutants avec le stress a induit des troubles de ^{Ca2 +} signaux. L'installation d'imagerie Ca ^{2 +} des cellules vivantes pourrait être adapté pour analyser Ca2 + dynamique au sein des différents compartiments de subcelluar ou dans différents types de cellules à l'aide de ^{Ca2 +} autres indicateurs.

Protocol

1. Aequorin Based Ca2 + Imaging Utilisation du système FAS Préparer les semis pour l'imagerie de luminescence. Stériliser graines de plantes d'Arabidopsis exprimant Aequorin avec une solution d'eau de Javel à 10% contenant 0,01% de Triton-100. Semez les graines stériles sur une plaque carrée (10 x 10 cm de plat carré de Pétri avec grille,) contenant la pleine force MS (Murashige et Skoog basale sel Mélange), 1% de saccharose et 1,2% d'agar. Placer les plaques verticalement …

Representative Results

Mannitol, NaCl et H 2 O 2 ont été utilisés comme substituts pour la déshydratation, le sel et le stress oxydatif stimuli, respectivement. Pour vérifier si les ions de métaux lourds Cu 2 + en synergie avec l'une de ces trois stimuli de stress, on a comparé la réponse de Ca2 + à chacune des stimuli de la présence ou de l'absence de Cu 2 +. Comme le montre la Figure 2, le SAF luminescence imagerie a révélé que les plantules Arabido…

Discussion

Nous avons démontré un système FAS pour l'enregistrement de la spatio-temporelle Ca2 ⁺ réponse des plants d'Arabidopsis. Cette ²⁺ système d'enregistrement FAS Ca offre une approche simple, sensible et robuste qui pourrait être adapté pour mesurer ^{Ca2 +} dynamique déclenchée par divers stimuli, en plus des stimuli de stress abiotiques qui sont présentés ici. Grâce à ce système, nous pouvons comparer facilement tissulaires ou des stimuli spécifiques spatio-tempore…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
10X10 cm square petri dish	VWR	60872-310
adhesive film	VWR	60941-062
polyethylene tubing	PerkinElmer	9908265
1 mL syringe	VWR	53548-000
silicone grease	Beckman	335148
2-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155379
8-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155409
luminescence imaging system	Princeton Instruments	N/A
inverted confocal laser-scanning microscope	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon A1R
Imaging software	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon Elements
ImageJ	NIH	N/A	Public domain, Java-based image processing program
DataGraph	Visual Data Tools Inc	N/A	DataGraph 3.1.1 is the newest version
coelenterazine	NanoLight Technolgies	#301B NF-BCTZ-FB
All purpose Bleach	Any local store	N/A
Triton X-100	Fisher	BP151500
MS salt	Phytotechnology Labs	M524-50L
sucrose	VWR	BDH8029-12KG
Agar	Sigma	A1296-5KG
Phytagel	Sigma	P8169-1KG