Måle romlig og tidsmessig Ca²⁺ Signaler i Arabidopsis planter

Summary

Ca ^{2 +} signale regulerer diverse biologiske prosesser i planter. Her presenterer vi tilnærminger for å overvåke abiotiske stresset indusert romlig og tidsmessig Ca ^{2 +-signaler} i Arabidopsis celler og vev ved hjelp av genetisk kodet Ca ^{2 +} indikatorer Aequorin eller Case12.

Abstract

Utviklings og miljømessige signaler indusere Ca ^{2 +} svingninger i planteceller. Stimulus-spesifikke romlige-temporal Ca ^{2 +} mønstre blir detektert av cellulære Ca ^{2 +} bindende proteiner som setter i gang Ca ^{2 +} signal kaskader. Men vi vet fortsatt lite om hvordan stimulans bestemt Ca ^{2 +-signaler} genereres. Spesifisiteten til et Ca ^{2 +-signal} kan tilskrives den raffinerte regulering av aktivitetene til Ca ^{2 +-kanaler} og / eller transportører som reaksjon på et gitt stimulus. Å identifisere disse cellulære komponenter og forstå deres funksjoner, er det avgjørende å bruke systemer som tillater en følsom og robust opptak av Ca ^{2 +-signaler} på både vev og cellulære nivåer. Genetisk kodet Ca ^{2 +} indikatorer som er målrettet mot ulike cellulære avdelinger har gitt en plattform for levende celle confocal avbildning av cellulære Ca ^{2 +-signaler.} Her beskriver vi instruksjons for bruk av to Ca ^{2 +} deteksjonssystemer: aequorin basert FAS (film selvklebende frøplanter) luminescens Ca ^{2 +} bildebehandling og case12 basert levende celle confocal fluorescens Ca ^{2 +} bildebehandling. Luminescens bildebehandling bruker FAS system gir en enkel, robust og sensitiv deteksjon av romlige og tidsmessige Ca ^{2 +-signaler} på vevet nivå, mens levende celle confocal avbildning ved hjelp Case12 gir samtidig påvisning av cytosolisk og kjernefysiske Ca ^{2 +-signaler} med høy oppløsning.

Introduction

Den plantecelle svarer til miljøet via signalering som koordinerer celle handlinger. En tidlig cellesignaleringshendelse som respons på miljømessige stimuli er en forbigående økning Ca ^{2 +.} Mønsteret, eller signaturen til en forbigående økning i frie Ca ^{2 +} konsentrasjon er preget av sin amplitude, frekvens og varighet. Distinkte spatio-temporale Ca ^{2 +} signaturer regulere ulike cellulære aktiviteter ^en. Spesifikke stimuli, som for eksempel varme, kulde, salt, tørke, lys eller plantehormoner, kan fininnstille spatio-temporal aktivitet av membran-lokaliserte Ca ^{2 +} kanaler og / eller transportører, noe som resulterer i konkrete Ca ^{2 +} signaturer. Selv Ca ^{2 +} transportører har blitt godt preget, er lite kjent om de molekylære identiteter og funksjoner av Ca ^{2 +} kanaler i planter ^en. Genetiske skjermer for mutanter med endret Ca ^{2 +} reaksjon på stress stimuli kan være en effektiv caoach for å identifisere de komponentene som utgjør Ca ^{2 +} signaturer. Nylig flere Aequorin basert Ca ^{2 +} deteksjonssystemer har blitt utviklet som lette genetiske skjermer for Ca ^{2 +} signale komponenter som svar på patogen angrep og abiotiske stresset ^2-4.

Aequorin ble først brukt til å oppdage Ca ^{2 +-signaler} i planter i begynnelsen av 1990-tallet ^fem. Siden da, har Aequorin blitt rettet til forskjellige cellulære avdelinger, slik som cytoplasma ^5, kjernen ^{6, 7} kloroplaster, tonoplast ^8, mitokondrier ^9, og stroma ^10, så vel som til forskjellige celletyper i roten for å overvåke cellespesifikk Ca ^{2 +} signaler ^11. Aequorin basert Ca ^{2 +} målinger avsløre romlig og tidsmessig Ca ^{2 +} respons av en populasjon av celler mot stress stimuli. Men i de fleste tilfeller, Ca ^{2 +} reaksjoner fra enkeltceller er unsynchronized i respons vevet ^4. Derfor ikke Aequorin Ca ^{2 +} opptak ikke nødvendigvis rapportere Ca ^{2 +-signalet} i enkeltceller. I de senere årene, genetisk kodet fluorescerende protein (FP) -baserte Ca ^{2 +} indikatorer, som gul Cameleon (YCS) ¹² og CASEs12 ¹³ har blitt brukt til å studere Ca ^{2 +} signaliserer med høy subcellulære oppløsning. YCS er fluorescens resonans energi overføring (FRET) -baserte Ca ^{2 +} indikatorer, som inneholder CFP og YFP varianter koblet av Ca ^{2 +} -binding protein calmodulin og calmodulin-bindende peptid M13. Calmodulin gjennomgår en konformasjonsendring som det binder seg til Ca ^{2 +,} og dermed bringer CFP og YFP tettere sammen, noe som resulterer i økt energioverføring (forbedret FRET). Gnage nivå over tid, omtrent beregnes som forholdet mellom YFP til CFP signalintensitet, reflekterer intracellulær Ca ^{2 +} dynamikk. Flere YC versjoner har blitt brukt i planter. YC3.6 var targeted til cytosol ^14,15, nucleus ^16, mitokondrier ^17, og plasma membran ^18, og YC4.6 og D4ER ble rettet til ER ^15,19, og D3cpv var rettet til de peroxisomes ^20. Transgene planter som uttrykker YCS tillate live-cell imaging av Ca ^{2 +} dynamikk innenfor ulike cellulære avdelinger av ulike celletyper. Tilfeller (formodentlig Ca lcium se nsor) er single sirkulært permuted fluorescerende proteiner (cpFPs) skjuler en calmodulin og calmodulin-bindende peptid M13. Ved binding til Ca ^{2 +,} tilfeller gjennomgå konformasjonsendringer, som fører til en økning av fluorescens intensitet. Korrelasjonen mellom sakens fluorescens respons og Ca ^{2 +} konsentrasjon gjør at intracellulær Ca ^{2 +} dynamikk måles kvantitativt. Den Case12 varianten har 12 ganger økt fluorescens i de Ca ^{2 +} -saturated former. N. benthiminana planter forbigående exprEssing Case12 eller Arabidopsis planter stabilt uttrykker Sak 12 ble brukt til å studere Ca ^{2 +} signalisering i forsvar og abiotiske stresset ^4,21. Asynkron romlig og tidsmessig Ca ^{2 +} svingninger i cellene reagerer på patogen angrep, eller til dehydrering stresset har blitt avslørt med Case12 basert Ca ^{2 +} bildebehandling.

Her presenterer detaljerte instruksjoner for Aequorin basert luminescence avbildning av vevs- og stimuli bestemt Ca ^{2 +} dynamikk i Arabidopsis frøplanter, og for konfokal avbildning av cytosolisk og kjernekraft Ca vi ^{2 +} dynamikk i Arabidopsis rot celler som uttrykker Sak 12. Luminescence avbildning av FAS kunne tilpasses analysere stressrelaterte Ca ^{2 +} dynamikk i intakte planter eller vev som ikke er beskrevet her, eller å skjerme mutageniserte Arabidopsis plantepopulasjoner for mutanter med endret stresset indusert Ca ^{2 +-signaler.} Den levende celle Ca ^{2 +} bildeoppsett kan tilpasses til å analysere Ca2 + dynamikk innenfor ulike subcelluar avdelinger eller i ulike celletyper bruker andre Ca ^{2 +} indikatorer.

Protocol

1. Aequorin Basert Ca 2 + Imaging Bruke FAS System Forbered frøplanter for luminescens bildebehandling. Sterilisere frø av Arabidopsis planter som uttrykker Aequorin med 10% blekemiddel løsning som inneholder 0,01% Triton-100. Purke sterile frø på en firkantet plate (10 x 10 cm firkantet petriskål med rutenett,) som inneholder full styrke MS (Murashige og Skoog Basal saltblanding), 1% sukrose, og 1,2% agar. Plasser platene vertikalt i et vekstkammer etter lagdeling ved 4 ° C i 2 dager <stron…

Representative Results

Mannitol, NaCl og H 2 O 2 ble brukt som proxyer for dehydrering, salt og oksidativt stress stimuli, henholdsvis. For å kontrollere om den tunge metallion Cu 2 + synergizes med en hvilken som helst av disse tre stress-stimuli, sammenlignet vi Ca2 + responsen til hver stimuli i nærvær eller fravær av Cu 2 +. Som vist i figur 2, FAS luminescens avbildning avslørte at Arabidoposis frøplanter reagert forskjellig på dehydrering, salt og oksidativt …

Discussion

Vi har vist en FAS system for registrering av romlig-temporal Ca ^{2 +} respons Arabidopsis frøplanter. Dette FAS Ca ^{2 +} opptakssystem gir en enkel, følsom og robust tilnærming som kan tilpasses for å måle Ca ^{2 +} dynamikk som utløses av ulike stimuli i tillegg til de abiotiske stress-stimuli som presenteres her. Ved hjelp av dette systemet kan vi enkelt sammenligne vevs- eller stimuli-spesifikke romlig-temporale Ca ^{2 +} dynamikk på hele anlegget nivå. Den høye følsomhete…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
10X10 cm square petri dish	VWR	60872-310
adhesive film	VWR	60941-062
polyethylene tubing	PerkinElmer	9908265
1 mL syringe	VWR	53548-000
silicone grease	Beckman	335148
2-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155379
8-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155409
luminescence imaging system	Princeton Instruments	N/A
inverted confocal laser-scanning microscope	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon A1R
Imaging software	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon Elements
ImageJ	NIH	N/A	Public domain, Java-based image processing program
DataGraph	Visual Data Tools Inc	N/A	DataGraph 3.1.1 is the newest version
coelenterazine	NanoLight Technolgies	#301B NF-BCTZ-FB
All purpose Bleach	Any local store	N/A
Triton X-100	Fisher	BP151500
MS salt	Phytotechnology Labs	M524-50L
sucrose	VWR	BDH8029-12KG
Agar	Sigma	A1296-5KG
Phytagel	Sigma	P8169-1KG