Den mest studerte aspekt av biokompatibilitet av dental-kompositter er deres cytotoksisitet 3D CLSM tidsforløp avbildning kombinert med fluorescerende signal kvantifisering tillater sensitiv evaluering av celle skjebne over tid. Benytte denne metoden kan være et effektivt verktøy for å vurdere cytocompatibility tann kompositter.
Det er generelt akseptert at in vitro-cellemateriale interaksjon er et nyttig kriterium for evalueringen av dentalmateriale biokompatibilitet. Målet med denne studien var å bruke 3D CLSM time lapse confocal bildebehandling for å vurdere in vitro biokompatibilitet av dental kompositter. Denne metoden gir en nøyaktig og følsom indikasjon på levedyktige cellerate i kontakt med tann kompositt ekstrakter. ELS ekstra lav krymping, en dental kompositt brukes for direkte restaurering, har blitt tatt som eksempel. In vitro vurdering ble utført på dyrkede primære humane gingivale fibroblastceller bruker Live / Død farging. Bilder ble oppnådd med FV10i confocal biologiske invertert system og analysert med FV10-ASW 3.1 Software. Bildeanalyse viste en meget svak cytotoksisitet i nærvær av de testede kompositten etter 5 timers tidsforløp. En liten reduksjon i cellelevedyktighet ble vist i kontakt med den testede sammensatte ekstrakter komparativeed å kontrollere celler. Funnene fremhevet bruken av 3D CLSM tid forfalle billeddiagnostikk som en sensitiv metode for å kvalitativt og kvantitativt vurdere biokompatibilitet oppførselen til dental kompositter.
En av de viktigste standardene sitert i ISO-anbefalinger for å definere biokompatibilitet er fraværet av materiale giftighet for cellene. Harpiks-baserte dental-kompositter kan frigi komponenter fra harpiksmatrise, som kan være opprinnelig på grunn av partiell polymerisasjon, og / eller senere på grunn av nedbrytningsprosesser over tid 1-4. Disse utgitt komponenter kommer i kontakt med orale vev og kan ha forskjellige ulemper som urtikarielle og slimhinne reaksjoner 5, utvikling av allergi og overfølsomhetsreaksjoner hos pasienter 6, modifikasjoner av gingivale fibroblaster morfologi og reduksjon på type I-kollagen protein 7, immunosuppression eller immunstimulering på mitogen -driven spredning av renset T-lymfocytter og miltceller 8 og DNA-skader i primære humane gingivale fibroblaster, som understreker deres gentoksisk potensial 9. Mange parametere kan påvirke tannkompositt toksisitet som for eksempel skyggen av composite, herdelampetid, den kjemiske sammensetningen av harpiksmonomeren, fyllstoffet og graden av omdannelse 10- 13. Etter in vitro-toksisk potensial av materialer kan forutsi in vivo-situasjoner, og kan sammenlignes med kliniske situasjoner ved studiet av noen relevante sluttpunkter. Cytotoksisiteten til dental kompositter og deres komponenter har blitt mye evaluert ved hjelp av cellekultursystemer 14- 16.
Disse in vitro-systemer har blitt utviklet for å vurdere dental-kompositter biokompatibilitet på sikt av: cellevekst, og celle apoptose ved hjelp av THP-1monocytes som cellene 17, cytotoksisitet i humane gingivale fibroblaster 18, keratinocytter som para celler, cellefunksjonalitet inflammatorisk potensial i HaCaT odontoblast- som MDPC-23 celler 19, reduksjon av totale RNA-nivåer, og betydelig økning i induksjon av apoptose på menneskelig gingival keratinocytter 20 ogDNA-skade på gingivale og papirmasse fibroblastceller 21.
Ulike metoder er foreslått å undersøke biokompatibilitet av dental kompositter. Kolorimetriske analyser som involverer spesifikke fargestoffer og lette adsorpsjon målinger, forblir den mest brukte, på grunn av deres relative enkelhet og lav kostnad 22- 26. Mikros analyse av lys kontrast ofte bruker mer tid og pådrar seg høyere kostnader. Imidlertid er disse mikroskopi teknikker har noen viktige fordeler. Observasjonen av cellestrukturen gir utvidet informasjon om opplevd toksiske effekter, og dermed gi mer relevante og sensitive data. Spesielt har innføringen av konfokal mikroskopi tillot 27 for observasjon av biologiske strukturer med bedre aksial oppløsning sammenlignet med tradisjonelle bredfeltavbildnings fluorescensmikroskoper. Derfor har konfokal bildebehandling blitt et kraftig undersøkende verktøy i ulike felt avmedisinske og naturvitenskapelige forskere. I motsetning til elektronisk mikroskopi-teknikker, skanning konfokal mikroskopi har evnen til å visualisere forskjellige komponenter av celler ved innlemmelse av bestemte fluoriserende markører. De fleste av disse spesifikke tracere er stabile i et vandig miljø, fornuftig målbar, billig og ikke-toksisk 28, slik at deres anvendelse i kliniske laboratorier, samt forskningsstudier. Videre er det ikke nødvendig for tidsinnstilte konfokal avbildning prøven tørking og fiksering som kreves for konvensjonell elektronisk mikroskopi-analyse, er således tidsavhengig kjøpet også mulig på prøver. Sammenlignet med den todimensjonale avbildning, gjør det mulig for konfokal bildeprinsipp en prøve under overflaten visualisering og den tredimensjonale struktur rekonstruksjon av de forskjellige oppnådde dybdebilder; noe som resulterer i mer nøyaktige og mer strukturelle detaljer 29, 30. Den foreliggende video-studien er et eksempel på bruk av tredimensjonal intervall Confocal Laser Skanning Mikroskopi (3D-CLSM) kombinert med live / Døde fluorescerende merking og signal kvantifisering som en innovativ metode. Den teknikk som presenteres i dette papiret har fordelen av å muliggjøre evaluering følsom og tidsserie avbildning av levende celler uten å endre ligningscellestruktur. Ingen forberedelse trinn er nødvendig før konfokal analyse. Tidligere var det samme farging brukes for å vurdere levedyktigheten til dyrkede spongiosa kjerner 31, men uten konfokal time-lapse følgende. Tilsvarende den samme tidsforsinkelse konfokal fremgangsmåte ble brukt for å vurdere tids erytromycin-kill aktivitet i bakterier av aktivert slam i henhold til deres Gram Type 32 ved hjelp av en bestemt bakterie Lev / døde flekker. Disse fremgangsmåter er nylig blitt tilpasset og brukt til å sammenligne toksisiteten av dental-kompositter basert på metakrylatmonomerer 11.
Biokompatibilitet materialoppførsel er den mest forutsetning parameter som skal evalueres før medisinsk bruk. Internasjonale standarder dekker medisinsk utstyr ISO 10993 33 og spesielt dentale materialer ISO 7405 34. Fraværet av de toksiske effektene til de omkringliggende cellene er nøkkelen normen i biokompatibilitet evaluering av slike materialer. Det er derfor cytotoksisitetstesting har slik betydning i vurderingen av tannmateriale biokompabilitet 35-37. ISO foreslo testmetoder kan være basert på metabolsk aktivitet eller membran integritet. Valgte endepunkter bør følge bestemte forhold for klassifisering uønskede bivirkninger indusert av et testmateriale for å minimere tiden og kostnaden av vurderings analyser. Den nåværende metoden for undersøkelse (3D konfokal time lapse imaging) er membran integritet basert. Cytotoksisitet evaluering via dette endepunktet synes å være en verdifull markør for celle biocompatibility med testede materialer og det er også godkjent ISO endepunkt. In vitro tester er utformet for å bestemme hvordan en materialprøve påvirker en bestemt celletype. Den kolorimetrisk MTT-analysen ble opprinnelig beskrevet av Mossman (1983) som en nyttig metode for måling av in vitro-cytotoksisitet og celleproliferasjon. MTT-testen er basert på omdannelsen av tetrazoliumsaltet i formazankrystaller med aktive celler, som bestemmer mitokondrielle aktivitet. Dette kan oversettes med levedyktighet sats 38. Gupta og medarbeidere rapporterte at smeltestyrketesten er den mest brukte metoden for å måle cytotoksisitet av kompositt harpikser. Ravsyre dehydrogenase og responser alkalisk fosfatase har også vært anvendt for samme formål 39. Imidlertid kan de skjebnen cellene ikke bli fulgt opp, ettersom MTT-analysen trenger å drepe cellene på hvert tidsmålepunkt. For å overvåke nærmere oppførselen til de fargede celler i den aktuelle studien, direkte observasjon av levende celler ble utført, takket være tid forfalle CLSM bildebehandling kombinert med en kort protokoll farging, automatisert bildeanalyse og fluorescerende signal kvantifisering.
Dental kompositter kommer i nær kontakt med orale vev, spesielt gingival og pulpal celler. Fibroblaster ville være målet for komponenter utgitt fra disse restorative kompositter 40-41. Videre har flere studier har rapportert at udødeliggjort celler og primære celler kan ha ulike cellulære responser i kontakt med biomaterialer. Primære celler ble funnet å være mer hensiktsmessig å vurdere biomaterialer effekter 42. Dette forklarer bruken av primære, humane fibroblastceller gingivale som cellemodell for vurdering av cytotoksisitet testet tann kompositt i denne studien. Giftig potensialet i de frigjorte stoffer fra tann kompositt har vært mye studert 43-44. For å kunne vurdere tHan cytotoksisk potensiale av materialer, kunne to kontaktmodell celler bli utført. I den direkte kontaktmodellsystem materialet blir direkte plassert med målceller, mens i indirekte kontakt-system, målrette celler som er i kontakt med eluerer fra biologiske medier. I kliniske applikasjoner og for restorative prosedyrer, blir tann kompositt plassert i indirekte kontakt med gingivale vev. Av denne grunn ble den aktuelle eksperimentelle protokoll fokusert på indirekte kontakt system med humane gingivale fibroblaster (celler i nærvær av de testede sammensatte ekstrakter). Som tidligere rapportert av Dahl og medarbeidere, cytotoksiske responser ble rangert som alvorlig (<30%), moderat (30-60%), liten (60-90%) eller ikke-cytotoksisk (> 90%) basert på aktiviteten i forhold til verdier oppnådd for 45 kontrollene. Derfor, i henhold til denne rangering og i lys av de oppnådde resultater (tabell 1), sammensatt ELS ekstra lav krymping kan bli rangert som very litt cytotoksiske og viste sammenlignbare atferd for å kontrollere celler under hele tiden lapse perioden. Ved hjelp av den nøyaktig samme fremgangsmåte undersøkelse, kan resultatene av denne undersøkelse sammenlignes med de av en nylig publisert studie. Den ELS ekstra lav krymping kompositt vist overlegen biokompatibilitet i forhold til de to tidligere testede kompositter anvendes for samme kliniske programmet som er den direkte restaurering 11. Videre studier er fortsatt nødvendig å etablere mer fullstendig sammenligning.
Når du bestemmer hvilken Cvtotoksisitetsmålinq å godkjenne for en bestemt endepunkt vurdering, er det viktig å forstå fordeler og begrensninger av hver analyse. Hovedformålet med konfokalt avbildnings er å oppnå en 3-D-arkitektur av celler og organer. Teknikken er i stand til å avsløre ikke bare en prøveoverflaten, men også dens undergrunnen. Protokollen er beskrevet her understreker bruken av 3D CLSM tid forfalle confocal bildebehandling, som sensitive fremgangsmåte for å vurdere in vitro biologiske forenelighetsmiddel oppførsel av en dental kompositt. Imidlertid, for å unngå de begrensninger som oppstår i dette arbeidet, anti-vibrasjons arbeidsstasjoner kan brukes for å tillate mer stabil og lengre tidsinnstilte avbildning; tabletop kunne isolere brukt konfokalmikroskoper systemet fra de skadelige effektene som vibrasjoner i laboratoriet kan forårsake. Videre materialer som skal brukes i munnhulen bør ideelt sett være uskadelig for de gingivale vev og bør ikke inneholde noen stoffer som kan forårsake systemisk toksisitet. I henhold til metodene som er brukt, og resultatene fra denne studien kan det konkluderes med at testet kompositt (ELS ekstra lav krymping) er ikke cytotoksisk i dagens forsøksbetingelser. Som følsomt CLSM metoden kan gi den initiale sats av levedyktige celler, kan andre muligheter bli forutsett for å vurdere flere endepunkter. Spesielt, som det har nylig blitt rapportert at kompositt monomerer påvirker celler through reaktive oksygenforbindelser (ROS) 46- 48, er ytterligere undersøkelser for å vurdere sammenhenger hvis noen mellom cytotoksisitet signale nettverk og ROS produksjon. Fremtiden protokollen kan være utformet for å samtidig evaluere ROS produksjon (H 2 O 2 og / eller O 2 – farging) og cytotoksisitet ratio (Live / dead flekker) ved hjelp av time lapse CLSM bildebehandling.
The authors have nothing to disclose.
Saremco Dental Switzerland and Olympus Microsystems France Companies are gratefully acknowledged for their financial support. Saremco Dental is also acknowledged for the generous donation of the dental composites ELS extra low shrinkage. The authors also wish to express their appreciation to Dr Simon Banks from the department of Chemistry (University College London) for his assistance with English revision.
Olympus Fluoview FV10i | Olympus | Confocal microscope | |
O2/Co2 Incubator | Pnasonic | MCO 5M | Cell incubation |
Live/Dead® Kit | Invitrogen | MP 03224 | Stain |
ELS extra low shrinkage® | Saremco | Dental composite | |
DMEM medium | Sigma | D 6046 | Culture medium |
Trypsin | Sigma | T1426 | harvesting cells |
chamber slide system | PAA | 14220040X | Culture chamber |
penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 | Cell culture |
Amphotericin B | PAA | P11-001 | Cell culture |
Foetal bovine serum | PAA | A11-101 | Cell culture |
Cell Counter | Merck Millipore | 00110230TP1 | Cell counting |