Den mest studerade aspekten av biokompatibilitet dentala kompositer är deras cytotoxicitet 3D CLSM time lapse avbildning i kombination med fluorescerande signal kvantifiering möjliggör känslig utvärdering av cell öde över tiden. Med hjälp av denna metod kan vara ett effektivt verktyg för att bedöma cytocompatibility av dentala kompositer.
Det är allmänt accepterat att in vitro-cellmaterial interaktion är ett användbart kriterium för utvärderingen av dentalmaterial biokompatibilitet. Syftet med denna studie var att använda 3D CLSM time lapse konfokala imaging att bedöma biokompatibilitet dentala kompositer in vitro. Denna metod ger en noggrann och känslig indikering av viabla cellhastighet i kontakt med dentala kompositextrakt. Den ELS extra låg krympning, ett tand komposit som används för direkt restaurering, har tagits som exempel. In vitro bedömning utfördes på odlade primära humana gingivala fibroblastceller med Live / Dead färgning. Bilder erhölls med FV10i konfokala biologiska inverterade systemet och analyseras med FV10-ASW 3.1 Software. Bildanalys visade en mycket svag cytotoxicitet i närvaro av den testade komposit efter 5 timmars tid förfaller. En liten minskning av cellviabilitet visades i kontakt med den testade komposit extrakten compared med kontrollceller. Resultaten fram användningen av 3D CLSM tidsförlopp avbildning som en känslig metod för att kvalitativt och kvantitativt utvärdera biokompatibilitet beteende dentala kompositer.
En av de viktigaste standarderna som anges i ISO-rekommendationer för att definiera biokompatibilitet är frånvaron av väsentlig toxicitet för cellerna. Hartsbaserade dentala kompositer kan släppa komponenter från hartsmatrisen, vilket kan vara en början på grund av partiell polymerisation, och / eller senare på grund av nedbrytningsprocesser under tiden 1-4. Dessa frigjorda komponenter kommer i kontakt med orala vävnader och kan ha olika nackdelar som urtikariella och slemhinnereaktioner 5, utveckling av allergi och överkänslighetsreaktioner hos patienter 6, ändringar av gingivala fibroblaster morfologi och minskning på typ I kollagen 7, immunosuppression eller immunstimulering på mitogen driven proliferation av renade T-lymfocyter och mjältceller 8 och DNA-skada i primära humana gingivala fibroblaster, vilket understryker deras genotoxiska potential 9. Många parametrar kan påverka dentala komposit giftighet, t.ex. skuggan av composite, ljushärdande, den kemiska sammansättningen av hartset monomer, fyllmedlet och graden av omvandling 10- 13. Sedan in vitro toxisk potential material kan förutsäga in vivo-situationer och kan jämföras med kliniska situationer genom att studera några relevanta endpoints. Cytotoxiciteten av dentala kompositer och deras komponenter har i stor utsträckning utvärderats med hjälp av cellodlingssystem 14- 16.
Dessa in vitro-system har utvecklats för att bedöma dental kompositer biokompatibilitet i tid av: celltillväxt och cell apoptos använder THP-1monocytes liknande celler 17, cytotoxicitet i humana gingivala fibroblaster 18, keratinocyter inflammatorisk potential i HaCaT liknande celler 2, cellfunktionalitet odontoblast- som MDPC-23 celler 19, minskning av de totala RNA-nivåer, och betydande ökning av induktion av apoptos på människors gingival keratinocyter 20 ochDNA-skador på gingivala och massa fibroblastceller 21.
Olika metoder föreslås för att undersöka biokompatibilitet dentala kompositer. Kolorimetriska analyser, som omfattar specifika färgämnen och ljusmätningar adsorption, är fortfarande den mest använda på grund av sin relativa enkelhet och låga kostnader 22- 26. Mikroskopi analys av ljus kontrast förbrukar ofta mer tid och medför högre kostnader. Dessa mikroskopitekniker Dock har några viktiga fördelar. Observationen av cellstrukturen ger utökad information om erfarna toxiska effekter, vilket ger mer relevanta och känsliga uppgifter. Framför allt har införandet av konfokalmikroskopi 27 tillåtet för observation av biologiska strukturer med förbättrad axiell upplösning jämfört med traditionella breda fält imaging fluorescensmikroskop. Därför har konfokal avbildning blivit ett kraftfullt utredningsverktyg inom olika områden avmedicinska och vetenskapliga undersökningar. I motsats till elektroniska mikroskopitekniker erbjuder scanning konfokalmikroskopi förmågan att visualisera olika komponenter i celler genom inkorporering av specifika fluorescerande markörer. De flesta av dessa särskilda spårämnen är stabila i en vattenmiljö, förnuftigt mätbara, billig och giftfri 28, vilket gör att deras användning i klinisk och laboratorieforskningsstudier. Dessutom är det inte nödvändigt för time lapse konfokal avbildning preparat torkning och fixering krävs för konventionell elektronisk mikroskopi analys är således tidsberoende förvärv också möjlig på prover. Jämfört med två-dimensionell avbildning, möjliggör en förlaga subsurface visualisering och den tre-dimensionella strukturen rekonstruktion från de olika erhållna djupbilder principen konfokal avbildning; vilket resulterar i, mer precisa och mer konstruktionsdetaljer 29, 30. Denna video Studien är ett exempel på användningen av tredimensionella tidsluckor Confocal Laser Scanning Microscopy (3D-CLSM) i kombination med Live / Dead fluorescerande märkning och signal kvantifiering som en innovativ metod. Tekniken presenteras i detta papper har fördelen att den möjliggör känslig utvärdering och tidsförlopp avbildning av levande celler utan att ändra bedömd cellstruktur. Inga förberedelsesteg krävs innan konfokal analys. Tidigare har samma färgning som används för att bedöma lönsamheten av odlade poröst ben kärnor 31 men utan konfokal time-lapse efter. Likaså samma tidsförlopp konfokala förfarande användes för att bedöma erytromycin tids kill aktivitet i bakterier av aktivt slam enligt deras Gram typ 32 att använda ett särskilt bakterier Live / dead färgning. Dessa metoder har nyligen anpassats och använts för att jämföra toxiciteten hos dentala kompositer baserade på metakrylatmonomerer 11.
Biokompatibilitet material beteende är det mest förutsättningen parameter som skall utvärderas innan medicinsk användning. Internationella standarder omfattar medicintekniska produkter ISO 10993 33 och specifikt dentala material ISO 7405 34. Frånvaron av de toxiska effekter på de omgivande cellerna är nyckeln normen i biokompatibilitet utvärdering av sådana material. Det är därför cytotoxicitet testning har sådan betydelse i bedömningen av dentala material biokompatibilitet 35-37. ISO föreslog provningsmetoder skulle kunna baseras på metabolisk aktivitet eller membranintegritet. Valda endpoints bör följa särskilda villkor för rankning biverkningar som orsakas av ett testmaterial för att minimera tiden och kostnaden för analyserna bedömnings. Den nuvarande metoden för undersökningen (3D konfokala tid förfaller imaging) är membranintegritet baserad. Utvärderings cytotoxicitet via denna endpoint verkar vara en värdefull markör för cell biocompatibility med utprovade material och det är också ISO-godkänd endpoint. In vitro-tester är utformade för att avgöra hur ett materialprov påverkar en särskild celltyp. Den kolorimetriska MTT-analysen som ursprungligen beskrivits av Mossman (1983) som en användbar metod för mätning av cytotoxicitet in vitro och cellproliferation. MTT Testet är baserat på omvandlingen av tetrazoliumsaltet i formazankristaller av aktiva celler, som bestämmer mitokondriell aktivitet. Detta kan översättas med livskraft hastighet 38. Gupta och medarbetare rapporterade att MTT-testet är den mest använda metoden för att mäta cytotoxicitet hos komposithartser. Bärnstens dehydrogenas och alkaliskt fosfatas svar har också använts för samma ändamål 39. Emellertid kan de öde celler inte att följas upp, eftersom MTT-analysen kräver att döda cellerna vid varje mätningstidpunkt. För att mer noggrant övervaka beteendet hos de färgade cellerna i den aktuella studien, direkt observation av levande celler utfördes, tack vare tid förfaller CLSM avbildning i kombination med en kort protokoll färgning, automatiserad bildanalys och fluorescerande signal kvantifiering.
Dentala kompositer kommer i nära kontakt med orala vävnader, speciellt gingivala och pulpal celler. Fibroblaster skulle bli föremål för komponenter som frigörs från dessa reparativ kompositer 40-41. Vidare har flera studier rapporterat att immortaliserade celler och primära celler kan ha olika cellulära svar som kommer i kontakt med biomaterial. Primära celler befanns vara lämpligare att bedöma biomaterial effekter 42. Detta förklarar användningen av primära humana gingivala fibroblastceller som cellmodell för cytotoxicitet bedömning av den testade dentalkomposit i den aktuella studien. Toxiciteten potentialen av de frigjorda ämnen från dentalkomposit har i stor utsträckning studerats 43-44. För att bedöma tHan cytotoxisk potential material, kunde två kontaktmodellceller utföras. I direkt kontakt modellsystem materialet direkt placeras med målcellema medan i indirekt kontakt systemet målceller är i kontakt med eluerar från biologiska medier. I kliniska tillämpningar och för återställande procedurer, är dental komposit placeras i indirekt kontakt med tandköttsvävnad. Av denna anledning har den nuvarande försöksprotokollet fokuserat på indirekt kontakt systemet med humana gingivala fibroblaster (celler i närvaro av de testade komposit extrakt). Som tidigare rapporterats av Dahl och medarbetare, var cytotoxicitet svar rankad som svår (<30%), måttlig (30-60%), lätt (60-90%) eller icke-cytotoxiska (> 90%) baserat på aktiviteten i förhållande till värden som erhålls för kontrollerna 45. Därför, enligt denna rangordning och mot bakgrund av de erhållna resultaten (tabell 1), komposit ELS extra låg krympning kan rankas som very något cytotoxiska och visade jämförbar beteende för att styra celler under hela intervallperioden. Genom att använda exakt samma undersökningsmetod, kan resultaten av denna studie kan jämföras med dem i en nyligen publicerad studie. Den ELS extra låg krympning komposit uppvisade bättre biokompatibilitet jämfört med de två tidigare testats kompositer används för samma kliniska program som är den direkta restaurering 11. Ytterligare studier är fortfarande nödvändigt att fastställa mer komplett jämförelse.
När man beslutar vilka cytotoxicitetsanalys bli godkänt för en viss endpoint bedömning, är det viktigt att förstå fördelarna och begränsningarna i varje analys. Det huvudsakliga syftet med konfokal avbildning är att uppnå en 3-D-arkitektur av celler och organ. Tekniken är i stånd att avslöja inte bara ett prov yta, utan också dess subsurface. Protokollet beskrivs här betonar användningen av 3D CLSM time lapse konfokala avbildning, som sensitiv metod för att bedöma biokompatibilitet beteendet hos en dental komposit in vitro. Men för att undvika de begränsningar som uppstår i detta arbete, Vibrations arbetsstationer kunde användas för att möjliggöra mer stabila och längre tidsförlopp avbildning; bordsskivan kan isolera använt konfokala systemet från de skadliga effekter som vibrationer i labbet kan orsaka. Dessutom material som skall användas i munhålan bör helst vara ofarliga för tandkötts vävnader och bör inte innehålla några ämnen som kan orsaka systemisk toxicitet. I enlighet med den metod som används och de resultat som erhållits från den aktuella studien kan man dra slutsatsen att den testade komposit (ELS extra låg krympning) inte cytotoxisk under nuvarande experimentella förhållanden. Som CLSM metoden lyhört kan ge initial hastighet på levande celler, kan andra möjligheter förutses att bedöma flera endpoints. Framför allt eftersom det har nyligen rapporterat att sammansatta monomerer påverkar celler thrgrundlig reaktiva syreradikaler (ROS) 46- 48, behövs ytterligare undersökningar för att bedöma korrelationer om någon mellan cytotoxicitet signalerings nätverk och ROS produktion. Den framtida protokollet skulle kunna utformas för att samtidigt utvärdera ROS produktion (H 2 O 2 och / eller O 2 – färgning) och cytotoxicitet ratio (Live / dead färgning) med intervall CLSM avbildning.
The authors have nothing to disclose.
Saremco Dental Switzerland and Olympus Microsystems France Companies are gratefully acknowledged for their financial support. Saremco Dental is also acknowledged for the generous donation of the dental composites ELS extra low shrinkage. The authors also wish to express their appreciation to Dr Simon Banks from the department of Chemistry (University College London) for his assistance with English revision.
Olympus Fluoview FV10i | Olympus | Confocal microscope | |
O2/Co2 Incubator | Pnasonic | MCO 5M | Cell incubation |
Live/Dead® Kit | Invitrogen | MP 03224 | Stain |
ELS extra low shrinkage® | Saremco | Dental composite | |
DMEM medium | Sigma | D 6046 | Culture medium |
Trypsin | Sigma | T1426 | harvesting cells |
chamber slide system | PAA | 14220040X | Culture chamber |
penicillin/streptomycin | PAA | P11-010 | Cell culture |
Amphotericin B | PAA | P11-001 | Cell culture |
Foetal bovine serum | PAA | A11-101 | Cell culture |
Cell Counter | Merck Millipore | 00110230TP1 | Cell counting |