ARN-Seq analyse de l'expression génique différentielle dans électroporation embryon de poulet de la moelle épinière
Summary
This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.
Abstract
In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.
Introduction
Les études génétiques sur les organismes vivants utilisent fréquemment l'embryon de poulet comme modèle parce que dans l'électroporation in ovo représente un moyen rapide et peu coûteux pour la transfection partiellement structures embryonnaires in vivo avec des constructions d'ADN 1-5. Des vecteurs d'expression bicistronique qui codent pour un produit de transcription contenant un rapporteur fluorescent en même temps que le gène d'intérêt, comme pCIG 6 ou 7 PMES, permettent une vérification rapide de la qualité de la transfection dans la région souhaitée sous un stéréomicroscope avant de traiter les embryons pour l'analyse en aval.
Avec les progrès récents dans le séquençage de l'ADN, il est maintenant possible d'obtenir des profils d'expression numériques entières du transcriptome à partir d'échantillons d'ARN en utilisant l'ARN-Seq 8,9. Par conséquent, au lieu des méthodes fastidieuses qui permettent l'analyse de seulement un petit nombre de produits de gènes en parallèle, telles que l'hybridation in situ, immunohistochimie et PCR quantitative, la préparation de banques d'ADNc pour ptséquençage à haut débit peut fournir des informations de l'ensemble du transcriptome. Observation des effets expérimentaux sur les niveaux de tous les gènes d'expression peut à son tour conduire à dégager sur les voies modifiés par la construction utilisée. Ceci est particulièrement facile si un assemblage génomique de l'organisme utilisé est disponible, donc l'embryon de poulet est de nouveau un modèle approprié.
Si l'utilisateur a accès à un centre de séquençage du génome fiable, le principal problème est l'obtention d'échantillons d'ARN de haute qualité. Ce travail démontre une méthode pour obtenir des échantillons d'ARN à partir de tubes de neurones transfectées appropriés pour l'ARN-Seq, ainsi que les étapes en aval pour l'analyse in silico des ensembles de données obtenus. Après électroporation à HH12-13 suivie par 48 heures d'incubation, le tronc transfectées moitiés de la moelle épinière ont été disséqués dans des conditions exemptes de ribonucléase, immédiatement lysées et plus protégés de la dégradation par ultra-bas jusqu'à ce que le gel purification d'ARN et bibliothèque preparation.
Le serveur public Galaxy 10 donne accès à des ressources gratuites pour l'analyse des données de séquençage à haut débit. La quantité d'espace offert pour les utilisateurs enregistrés est suffisant pour de petites expériences, éliminant ainsi le besoin d'une infrastructure informatique locale. L'analyse des données de l'ARN-Seq comprend le filtrage, l'alignement et la quantification / comparaison de l'expression du gène. Bien qu'il existe des lignes directrices générales pour l'analyse des données de l'ARN-Seq, les paramètres de filtrage dépendra en grande partie sur la qualité de séquençage et devraient être déterminés après analyse de contrôle de la qualité des données brutes.
Ce protocole décrit les étapes pour obtenir et comparer les profils d'ARN-Seq de poulet embryonnaire de la moelle épinière transfectées in vivo. Comme un résultat représentatif, la comparaison des ensembles de données obtenues à partir de deux échantillons de contrôle indépendants transfectées avec un vecteur vide ont montré que le procédé est reproductible et devrait permettre l'identification de différentiellement exprestranscriptions sed dans les échantillons expérimentaux. Par conséquent, l'application de cette méthode a le potentiel d'augmenter considérablement le nombre de découvertes après une expérience unique et de fournir ainsi un vaste ensemble de données pour l'enquête subséquente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici nous fournissons des lignes directrices pour l'analyse des effets après l'électroporation de la poule de la moelle épinière. Bien que l'électroporation de vecteurs d'ADN est plus fréquemment utilisé pour surexprimer un gène d'intérêt, on peut aussi utiliser des constructions codant des dominants négatifs, protéines quimeric ou précurseurs de siRNA pour créer les conditions fonction des gènes knock-down 19-21. En effet, la comparaison des profils de transcriptome résulta…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CYIY is supported by FAPESP (2012/14421-5) and FMV is supported by a fellowship from FAPESP (2009/53695-0). We thank the DNA Technologies Core at University of California, Davis for preparation and sequencing of the RNA-Seq libraries used in this work, the Galaxy team for providing an excellent and free interface for high-throughput sequencing data analysis tools and Dr. Marianne Bronner for allowing us to film in her laboratory space.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Indian ìnk | Any supplier | ||
| 18G x 1 1/2 needle | BD | 305196 | |
| 3 ml syringe | BD | 309657 | |
| Tris | MP Biomedicals | 819620 | |
| F D & C Blue 1 | Spectra Colors Corporation | 5.FC.0010P0 | Food Dye used to visualize DNA injection |
| Ringer's solution (1 L) | |||
| – 7.2 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| – 0.37 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| – 0.225 g CaCl2.2H2O | Fisher Scientific | 10043-52-4 | |
| – 0.217 g Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| – 0.02 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| – ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.4 | |||
| – ddH2O to 1 L | |||
| – Filter and autoclave | |||
| PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L) | |||
| – 8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S-9888 | |
| – 0.2 g KCl | Sigma-Aldrich | P-4504 | |
| – 1.15 g Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S-9390 | |
| – 0.2 g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| – ddH2O to 800 ml and adjust pH to 7.2 | |||
| – ddH2O to 1 L and filter | |||
| – 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate) | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| – Shake vigorously and let stand overnight at room temperature | |||
| – Autoclave | |||
| Sieved spoon | Any supplier | ||
| Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes | Corning Life Sciences | 351007 | |
| RNaseZap RNase decontamination solution | Life Technologies | AM9780 | |
| Fine point surgical scissors | Any supplier | ||
| Straight fine point tweezers | Any supplier | ||
| Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes | Kimble Chase | 40A502 | |
| 9'' glass Pasteur pipette | Any supplier | ||
| Manual pipette pump | Any supplier | ||
| Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes | Corning Life Sciences | MCT-150-C | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| RNAlater solution for RNA stabilization | Life Technologies | AM7020 | |
| RNAqueous total RNA isolation kit | Life Technologies | AM1912 | |
| Molecular Biology Grade Ethanol | Any supplier | ||
| RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| 2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2939AA | |
| Truseq RNA Sample Preparation Kit v2 | Illumina | RS-122-2001/RS-122-2002 |
Referências
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