طرق للبشرة إصابة وفحوصات لالردود الجرح في<em> C. ايليجانس</em
Summary
The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.
Abstract
وC. ايليجانس البشرة وبشرة تشكل طبقة الجلد بعد متطورة البسيطة التي يمكن إصلاح الأضرار المحلية الناجمة عن اصابة. لقد أضاءت الدراسات الردود الجرح وإصلاح في هذا النموذج فهمنا للهيكل الخلية وردود الجينومية إلى تلف الأنسجة. طريقتين الأكثر استخداما لالجرح C. ايليجانس الجلد البالغين من الغرزات مع الإبر حقن مكروي، وأشعة الليزر المحلي. إبرة اصابة محليا يعطل بشرة، البشرة، وما يرتبط بها من المصفوفة خارج الخلية، وأيضا قد تضر الأنسجة الداخلية. النتائج أشعة الليزر في الضرر أكثر محلية. جرح يتسبب في سلسلة من ردود يعاير بسهولة بما في ذلك البشرة مرتفعة الكالسيوم 2+ (ثواني دقيقة)، وتشكيل وإغلاق حلقة التي تحتوي على الأكتين في موقع الجرح (1-2 ساعة)، والنسخ مرتفعة من الببتيد الجينات المضادة للميكروبات (2-24 ساعة)، وتشكيل ندبة. أساسا كل نوع البرية الحيوانات الكبار البقاء على قيد الحياة جرح، حيثكما المسوخ المعيبة في إصلاح الجرح أو استجابات أخرى تظهر انخفاض البقاء على قيد الحياة. وتعرض بروتوكولات مفصلة لإبرة وجرح الليزر، وفحوصات لتحديد الكميات والتصور الردود الجروح والعمليات إصلاح (ديناميات الكالسيوم، وديناميات الأكتين، مضادات الميكروبات الببتيد الاستقراء، والبقاء على قيد الحياة).
Introduction
آليات الشفاء الجلد الجروح ذات أهمية بيولوجية أساسية وذات الصلة بصحة الإنسان. ويضم التئام الجروح في الفقاريات والثدييات سلسلة معقدة من استجابات منسقة من أنسجة متعددة ويشير 1. كثير من الكائنات نموذج الجيني بسيطة هي أيضا قادرة على شفاء الجروح الجلدية 2. ولذلك من مصلحة لتحليل نماذج الانقياد وراثيا من إصلاح الجرح الجلد. نحن وغيرنا قد بدأت في استخدام انواع معينة ايليجانس نموذجا جديدا للشفاء الجرح الجلد 3،4. والهدف من هذا البروتوكول هو تمكين مجموعة أوسع من الباحثين لاستخدام C. ايليجانس كأداة للتحقيق في الآليات الجزيئية والخلوية من البشرة التئام الجروح.
وC. ويضم ايليجانس الجلد البشرة (المعروف أيضا باسم اللحمة) وبشرة خارج الخلية 5. يتم تشكيل البشرة الكبار من عدد صغير من syncytia متعدد النوى، والتي من أكبر هو مخلى كnown كما hyp7. البشرة هي ظهارة البسيطة التي تفرز بشرة على سطحه قمي. الجلد يمكن أن يدافع بنشاط ضد مسببات الأمراض اختراق الجلد وإصلاح الجروح الصغيرة (4). إصلاح الجرح من C. ايليجانس الجلد هو قوي، وتقريبا جميع الحيوانات البرية نوع البقاء على قيد الحياة يمكن البقاء على قيد الحياة الجروح الصغيرة الناجمة عن الإبر، أو تلف الجلد المحلية التي تسببها أشعة الليزر. C. ايليجانس جرح الجلد مشغلات مجموعة من الردود، بما في ذلك البشرة استجابة فطرية المناعة، وإغلاق الجروح، وتشكيل ندبة 4. البشرة البالغين في مرحلة ما بعد الإنقسامية، وينطوي على التئام الجروح الاستجابات الخلوية المحلية في مقابل انتشار البشرة أو الهجرة الخلية. لقد أثبتنا أن جرح الجلد يتسبب في زيادة كبيرة ومطردة في البشرة الكالسيوم 2+، الأمر الذي يتطلب قناة TRPM غشاء تحويل الغاز إلى سوائل-2 والداخلية الكالسيوم 2+ مخازن 3. مطلوب البشرة الكالسيوم 2+ إشارة لتشكيل وإغلاق حلقات F-أكتين في التعليم الجامعيالموقع اوند. كما يدفع جرح الاستجابات المناعية الفطرية التي تنشط النسخ من المكاتب الإقليمية للمرأة مثل البرمجة اللغوية العصبية-29. النسخ الناجم عن جرح المكاتب الإقليمية للمرأة يعتمد على TIR-1 / PMK-1 P38 MAP كيناز سلسلة يتصرف بشكل مستقل في البشرة 4. سوف العيوب سواء في إشارة مسار الكالسيوم 2+ أو في الاستجابة المناعية الفطرية يؤدي إلى انخفاض البقاء على قيد الحياة بعد إصابة. هيكل بسيط نسبيا من C. ايليجانس البشرة، قابلية الإستطراق الجيني والمزايا لفي الجسم الحي التصوير تجعل من نظام ممتاز لدراسة جوانب متعددة من إصلاح الجرح.
هنا نقدم بروتوكولات الطرق الشائعة اثنين من جرح: جرح إبرة وجرح الليزر. جرح إبرة لا يتطلب أي معدات متخصصة (غير مجتذب إبرة)، ومع خبرة لا يمكن أن يؤديها على مئات من الديدان يوميا. يتم تنفيذ جرح إبرة على الحيوانات التي تنمو على لوحات أجار. في المقابل، يتم إجراء جرح الليزر على أنيسالحيوانات thetized التي شنت على أجار منصات تحت ساترة، ومناسب للتصوير المباشر لالاستجابات الخلوية للتلف.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأساليب المقدمة هنا للإبرة وجرح الليزر توفر نهج تكميلية لتقييم قدرة ظهارة البشرة لإصلاح الضرر. جرح الليزر محلية نسبيا و(اعتمادا على تكوين ليزر) يمكن أن تقتصر على البشرة، في حين جرح إبرة يعطل البشرة، بشرة، والمرجح الأغشية الطابق السفلي الداخلية. إبرة جرح قد تشبه بشك?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Needle wounding methods for C. elegans were first developed by Nathalie Pujol and Jonathan Ewbank; we thank Nathalie Pujol for comments on the manuscript. Work in our laboratory on C. elegans epidermal wound repair is supported by a grant from the NIH to A.D.C. (R01 GM054657).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Plastic Petri plate | Tritech Research | T3308 | 60 mm |
| Levamisole | Sigma | L9756 | 12 mM |
| Borosilicate Glass Capillary | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-2000 | |
| Worm pick (Platinum wire) | Tritech Research | PT-9010 | |
| M9 solution | Home-made | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Sterilize by autoclaving | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | Use 500 ml for 50 worms |
| iQ SYBR Green | Bio-Rad | 1708882 | |
| SuperScript III | Invitrogen | 18080-051 | |
| PCR machine | Bio-Rad | C1000/CFX96 | |
| 96-well PCR tubes | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Image analysis software | Molecular Devices | Metamorph | |
Referências
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Sonnemann, K. J., Bement, W. M. Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 237-263 (2011).
- Xu, S., Chisholm, A. D. A Gαq-Ca2+ signaling pathway promotes actin-mediated epidermal wound closure in C. elegans. Curr Biol. 21, 1960-1967 (2011).
- Pujol, N., et al. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Curr Biol. 18, 481-489 (2008).
- Chisholm, A. D., Xu, S. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. II: differentiation and physiological roles. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 879-902 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook : the online review of C. elegans biology. , 1-11 .
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in cell biology. 48, 225-250 .
- Pujol, N., et al. Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides. PLoS Pathog. 4, (2008).
- Tong, A., et al. Negative regulation of Caenorhabditis elegans epidermal damage responses by death-associated protein kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 1457-1461 (2009).
- Zugasti, O., Ewbank, J. J. Neuroimmune regulation of antimicrobial peptide expression by a noncanonical TGF-beta signaling pathway in Caenorhabditis elegans epidermis. Nat Immunol. 10, 249-256 (2009).
- Zhao, X., et al. Microfluidic chip-based C. elegans microinjection system for investigating cell-cell communication in vivo. Biosensor., & Bioelectronics. 50, 28-34 (2013).
- Jansson, H. B. Adhesion of Conidia of Drechmeria coniospora to Caenorhabditis elegans Wild Type and Mutants. J Nematol. 26, 430-435 (1994).
- Hodgkin, J., Kuwabara, P. E., Corneliussen, B. A novel bacterial pathogen, Microbacterium nematophilum, induces morphological change in the nematode C. elegans. Curr Biol. 10, 1615-1618 (2000).
- Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. Generation of transgenic C. elegans by biolistic transformation. J Vis Exp. (42), (2010).
- Hashmi, S., et al. Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures. BioTechniques. 19, 766-770 (1995).
