Metoder til Hud sårbarhed og Analyser for Wound Svar i<em> C. elegans</em
Summary
The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.
Abstract
C. elegans epidermis og neglebånd danner en enkel, men sofistikeret hudlag, der kan reparere lokaliserede skader som følge af såret. Undersøgelser af sår svar og reparation i denne model har belyst vores forståelse af cytoskeletal og genomiske reaktioner på vævsskade. De to mest almindeligt anvendte metoder til at vikles C. elegans voksen hud er prikker med mikroinjektion kanyler og lokal laser bestråling. Needle sårede lokalt forstyrrer kutikula, epidermis og tilhørende ekstracellulær matrix, og kan også beskadige de indvendige væv. Laser bestråling giver mere lokaliseret skade. Sårdannelse udløser en række let analyseres svar inklusive forhøjet epidermal Ca 2+ (sekunder-minutter), dannelse og lukning af en actin-holdige ring på sårstedet (1-2 timer), forhøjet transkription af antimikrobielle peptid gener (2-24 HR) og ardannelse. Hovedsagelig alle vildtype voksne dyr overlever sårdannelse, hvorsom mutanter defekte i sår reparation eller andre reaktioner viser nedsat overlevelse. Detaljerede protokoller for nål og laser såret, og assays til kvantificering og visualisering af sår svar og reparation processer (Ca dynamik, actin dynamik, antimikrobielle peptid induktion og overlevelse) præsenteres.
Introduction
Hud sårheling mekanismer er af grundlæggende biologisk interesse og relevans for menneskers sundhed. Sårheling i hvirveldyr og pattedyr omfatter en kompleks serie af koordinerede responser af flere væv og signalanlæg 1. Mange simple genetiske model organismer er også i stand til healing hudsår 2. Det er derfor af interesse at analysere genetisk medgørlige modeller af hudsår reparation. Vi og andre er begyndt at bruge Caenorhabditis elegans som ny model for huden sårheling 3,4. Målet med denne protokol er at gøre det muligt for et bredere sæt forskere til at bruge C. elegans som et redskab til at undersøge molekylære og cellulære mekanismer epidermal sårheling.
C. elegans hud omfatter epidermis (også kendt som hypodermis) og det ekstracellulære kutikula 5. De voksne epidermis er dannet af et lille antal multinucleate syncytia, hvoraf den største er syncytium Known som hyp7. Epidermis er en simpel epithel, som udskiller kutikula på dens apikale overflade. Huden kan aktivt forsvare sig mod hud-gennemtrængende patogener og reparere små sår 4. Sårheling af C. elegans hud er robust, da næsten alle vildtype dyr overlever kan overleve små stiksår forårsaget af kanyler eller lokal hudskader forårsaget af laser bestråling. C. elegans hud såret udløser en suite af svarene, herunder et immunrespons epidermal medfødte, sårlukning, og ardannelse 4. De voksne epidermis er post-mitotiske, og sårheling indebærer lokale cellulære reaktioner i modsætning til epidermal proliferation eller celle migration. Vi har vist, at huden såret udløser en stor og vedvarende stigning i epidermal Ca2 +, som kræver membranen TRPM kanal GTL-2 og interne Ca 2 + butikker 3. Der kræves epidermal Ca 2+ signal for dannelse og lukning af F-actin ringe på wound site. Anskydning inducerer også medfødte immunrespons, der aktiverer transkriptionen af AMP'er såsom NLP-29. Såret-induceret transkription af AMP'er er afhængig af en TIR-1 / PMK-1 p38 MAP-kinase kaskade handler autonomt i epidermis 4. Defekter i enten Ca2 + signalvejen eller i medfødte immunreaktion vil føre til lavere overlevelse efter sårdannelse. Den relativt enkle struktur af C. elegans epidermis, dets genetiske sporbarhed og fordele til in vivo imaging gør det et fremragende system til at studere flere aspekter af sårheling.
Her præsenterer vi protokoller for de to almindelige metoder til sårdannelse: nål sårdannelse og laser sårdannelse. Needle såring kræver ingen specialudstyr (bortset nålen aftrækker), og med erfaring kan udføres på flere hundrede orme per dag. Needle såring udføres på dyr vokser på agarplader. I modsætning hertil er laser såring udført på Anesthetized dyr monteret på agar puder under et dækglas, og er velegnet til billeddannelse af de cellulære reaktioner på skader.
Protocol
Representative Results
Discussion
De metoder, der præsenteres her for nål og laser såret giver komplementære tilgange til vurdering af, om den epidermale epitel at udbedre skader. Laser såring er relativt lokaliseret og (afhængig af laser konfiguration) kan begrænses til overhuden, mens nålen såret forstyrrer overhuden, neglebånd og sandsynlige interne basalmembraner. Needle såring kan mere præcist ligne sår påført af patogener eller mekaniske skader på det naturlige miljø. Som regel nål såret kræver mere øvelse at opnå præcise s?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Needle wounding methods for C. elegans were first developed by Nathalie Pujol and Jonathan Ewbank; we thank Nathalie Pujol for comments on the manuscript. Work in our laboratory on C. elegans epidermal wound repair is supported by a grant from the NIH to A.D.C. (R01 GM054657).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Plastic Petri plate | Tritech Research | T3308 | 60 mm |
| Levamisole | Sigma | L9756 | 12 mM |
| Borosilicate Glass Capillary | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-2000 | |
| Worm pick (Platinum wire) | Tritech Research | PT-9010 | |
| M9 solution | Home-made | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Sterilize by autoclaving | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | Use 500 ml for 50 worms |
| iQ SYBR Green | Bio-Rad | 1708882 | |
| SuperScript III | Invitrogen | 18080-051 | |
| PCR machine | Bio-Rad | C1000/CFX96 | |
| 96-well PCR tubes | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Image analysis software | Molecular Devices | Metamorph | |
Referências
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Sonnemann, K. J., Bement, W. M. Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 237-263 (2011).
- Xu, S., Chisholm, A. D. A Gαq-Ca2+ signaling pathway promotes actin-mediated epidermal wound closure in C. elegans. Curr Biol. 21, 1960-1967 (2011).
- Pujol, N., et al. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Curr Biol. 18, 481-489 (2008).
- Chisholm, A. D., Xu, S. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. II: differentiation and physiological roles. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 879-902 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook : the online review of C. elegans biology. , 1-11 .
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in cell biology. 48, 225-250 .
- Pujol, N., et al. Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides. PLoS Pathog. 4, (2008).
- Tong, A., et al. Negative regulation of Caenorhabditis elegans epidermal damage responses by death-associated protein kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 1457-1461 (2009).
- Zugasti, O., Ewbank, J. J. Neuroimmune regulation of antimicrobial peptide expression by a noncanonical TGF-beta signaling pathway in Caenorhabditis elegans epidermis. Nat Immunol. 10, 249-256 (2009).
- Zhao, X., et al. Microfluidic chip-based C. elegans microinjection system for investigating cell-cell communication in vivo. Biosensor., & Bioelectronics. 50, 28-34 (2013).
- Jansson, H. B. Adhesion of Conidia of Drechmeria coniospora to Caenorhabditis elegans Wild Type and Mutants. J Nematol. 26, 430-435 (1994).
- Hodgkin, J., Kuwabara, P. E., Corneliussen, B. A novel bacterial pathogen, Microbacterium nematophilum, induces morphological change in the nematode C. elegans. Curr Biol. 10, 1615-1618 (2000).
- Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. Generation of transgenic C. elegans by biolistic transformation. J Vis Exp. (42), (2010).
- Hashmi, S., et al. Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures. BioTechniques. 19, 766-770 (1995).
