創傷応答のためのスキン傷つけ処理のための方法およびアッセイ<em> C。エレガンス</em
Summary
The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.
Abstract
C. elegansの表皮とキューティクルが負傷に起因する局所的な損傷を修復することができますシンプルで洗練されたスキン層を形成する。このモデルにおける創傷応答および修復の研究は、細胞骨格および組織損傷に対するゲノム応答の我々の理解を照らしている。 C.を創傷に、2つの最も一般的に使用される方法虫の大人の皮膚マイクロインジェクション針、および現地レーザー照射との呵責である。針創傷は、局所的にキューティクル、表皮、および関連する細胞外マトリックスを破壊し、また内部組織を損傷することがあります。より局所的な損傷でレーザー照射をもたらす。創傷は、上昇した表皮のCa 2+（秒分）、創傷部位（1〜2時間）でのアクチン含有環の形成及び閉鎖、抗菌ペプチド遺伝子の上昇転写（2-24含め容易にアッセイした応答の連続をトリガーする時間）、および瘢痕形成。基本的にすべての野生型の大人の動物は、どこに創傷を生き残る創傷修復または他の応答における欠損変異株として生存率の低下を示している。詳細な針とレーザー創傷のためのプロトコル、および定量および創傷応答と修復プロセス（カルシウム動態、アクチン動態、抗菌ペプチドの誘導、および生存）の可視化のためのアッセイが提示されている。
Introduction
皮膚創傷治癒のメカニズムは基本的な生物学的興味のものであり、人間の健康に関連する。脊椎動物および哺乳動物における創傷治癒は、複数の組織および1シグナルの協調的応答の複雑な系列を含む。多くの単純な遺伝的モデル生物はまた、皮膚創傷2治癒することができる。これは、皮膚創傷修復の遺伝的に扱いやすいモデルを分析することが重要である。我々と他の人は肌のための新しいモデルは3,4創傷治癒などの線虫（Caenorhabditis elegans）を使用し始めている。このプロトコルの目的は、Cを使用する研究者のより広範なセットを可能にすること表皮の創傷治癒の分子·細胞メカニズムを調べるためのツールとして虫 。
C.虫の皮膚は（また皮下組織として知られている）、表皮および細胞外のキューティクル5を備えている。大人の表皮は最大でシンシチウムkがあるの多核合胞体の数が少ないから形成されているnownとしてhyp7。表皮は、その頂端表面にキューティクルを分泌する簡単な上皮である。皮膚は積極的に皮膚浸透性の病原体から身を守る、小さな傷4を修復することができます。 C.の創傷修復エレガンススキンはすべて、野生型動物は針、又はレーザ照射による局所的な皮膚損傷による小さな刺し傷に耐えることができる生き残るほぼ、ロバストである。C. elegansの皮膚創傷は、表皮自然免疫応答、創傷閉鎖、および瘢痕形成4を含む応答のスイートを、トリガされます。大人の表皮は有糸分裂後で、創傷治癒、上皮増殖または細胞移動とは対照的に、局所的な細胞応答を含む。我々は、皮膚の創傷が膜TRPMチャネルGTL-2と内部のCa 2+を格納3を必要とする、表皮のCa 2+が大きく、持続的な増加を誘発することが示されている。表皮のCa 2+シグナルは、少なくともF-アクチンリングの形成及び閉鎖WOために必要とされるウントサイト。創傷はまた、NLP-29のようなAMPの転写を活性化する自然免疫応答を誘導する。 AMPの創傷誘導性転写は、表皮4に自律的に動作するTIR-1 / PMK-1 p38 MAPキナーゼカスケードに依存している。どちらのCa 2+シグナル伝達経路におけるまたは先天性免疫応答の欠陥は低い生存創傷後につながる。 C.の比較的単純な構造elegansの表皮、in vivoイメージングのためにその遺伝従順および利点は、創傷修復の複数の側面を研究するためにそれを優れたシステムを作る。
針創傷およびレーザー創傷：ここでは、創傷の2つの一般的な方法のためのプロトコルを提示する。ニードル創傷は（針プラー以外）何の特殊な装置を必要とせず、経験で一日あたりのワームの何百もの上で実行することができます。針創傷寒天プレート上で生育した動物に対して行われる。対照的に、レーザー創傷はanes上で実行されるthetized動物はカバーガラスの下のパッド寒天上に搭載されており、損傷に対する細胞応答のライブイメージングに適しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
針、レーザー創傷のためにここに提示される方法は、損傷を修復する表皮上皮の能力を評価するための補完的なアプローチを提供する。針創傷は表皮、キューティクル、そしておそらく内部基底膜を破壊に対し、レーザー創傷は、表皮に限定することができ、比較的ローカライズと（レーザーの構成に応じて）である。針創傷は、より正確に病原体または自然環境での機械的な損傷によって?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Needle wounding methods for C. elegans were first developed by Nathalie Pujol and Jonathan Ewbank; we thank Nathalie Pujol for comments on the manuscript. Work in our laboratory on C. elegans epidermal wound repair is supported by a grant from the NIH to A.D.C. (R01 GM054657).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Plastic Petri plate | Tritech Research | T3308 | 60 mm |
| Levamisole | Sigma | L9756 | 12 mM |
| Borosilicate Glass Capillary | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-2000 | |
| Worm pick (Platinum wire) | Tritech Research | PT-9010 | |
| M9 solution | Home-made | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Sterilize by autoclaving | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | Use 500 ml for 50 worms |
| iQ SYBR Green | Bio-Rad | 1708882 | |
| SuperScript III | Invitrogen | 18080-051 | |
| PCR machine | Bio-Rad | C1000/CFX96 | |
| 96-well PCR tubes | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Image analysis software | Molecular Devices | Metamorph | |
Referências
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