Metoder for Skin såre og Analyser for Wound Responses i<em> C. elegans</em
Summary
The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.
Abstract
C. elegans epidermis og hårstråene danne en enkel, men sofistikert hudlaget som kan reparere lokalisert skade som følge av såret. Studier av sår svar og reparasjon i denne modellen har opplyst vår forståelse av cytoskeletal og genomiske svar på vevsskade. De to mest brukte metodene for å sår C. elegans voksen hud er stikk med mikroinjeksjon nåler, og lokale laser bestråling. Nål såret lokalt forstyrrer skjellaget, epidermis, og tilknyttet ekstracellulære matrise, og kan også skade indre vev. Laser bestråling gir mer lokaliserte skader. Såret utløser en rekkefølge av lett analysert responser inkludert epidermal forhøyet Ca 2 + (sekunder minutter), dannelse og lukking av en aktin inneholdende ring på sårstedet (1-2 timer), forhøyet transkripsjon av antimikrobielle peptid gener (2-24 hr), og arrdannelse. Hovedsak alle villtype voksne dyr overleve såret, hvorsom mutanter defekte i såret reparasjon eller andre reaksjoner viser redusert overlevelse. Detaljerte protokoller for nål og laser såret, og analyser for kvantifisering og visualisering av sår svar og reparasjonsprosesser (Ca dynamikk, aktin dynamikk, antimikrobielle peptid induksjon og overlevelse) presenteres.
Introduction
Hud sår helbredende mekanismer er av grunnleggende biologisk interesse og relevant for menneskers helse. Sårtilheling i virveldyr og pattedyr består av en kompleks serie av koordinerte reaksjoner fra flere vev og signalanlegg 1. Mange enkle genetisk modellorganismer er også i stand til å helbrede sår på huden to. Det er derfor av interesse å analysere genetisk medgjørlig modeller av huden sår reparasjon. Vi og andre har begynt å bruke Caenorhabditis elegans som ny modell for huden sårtilheling 3,4. Målet med denne protokollen er å muliggjøre et bredere sett av forskere til å bruke C. elegans som et verktøy for å undersøke molekylære og cellulære mekanismer for epidermal sårtilheling.
C. elegans hud består av epidermis (også kjent som hypodermis) og ekstracellulære cuticle 5. Voksen epidermis er dannet av et lite antall multinucleate syncytia, hvorav den største er syncytium known som hyp7. Overhuden er en enkel epitel som skiller ut skjellaget på sin apikale overflaten. Huden kan aktivt forsvare seg mot hud-trengende patogener og reparere små sår fire. Sårheling av C. elegans hud er robust, som nesten alle villtype dyr overlever kan overleve små sår forårsaket av nåler, eller lokale hudskader forårsaket av laserbestråling. C. elegans hud såret utløser en pakke med tiltak, inkludert en epidermal medfødte immunrespons, sårheling, og arrdannelse 4. De voksne epidermis er post-mitotisk, og sårtilheling involverer lokale cellulære responser i motsetning til epidermal spredning eller celle migrasjon. Vi har vist at hudens såret utløser en stor og varig økning av epidermal Ca 2+, krever membranen utvikler TRPM-kanalen GTL-2 og interne Ca 2 + 3 butikker. Epidermal Ca2 + signal er nødvendig for dannelse og lukking av F-aktin ringer på wound nettstedet. Sårende induserer også medfødte immunresponser som aktiverer transkripsjon av forsterkere som NLP-29. Sårene-indusert transkripsjon av forsterkere er avhengig av en TIR-1 / PMK-1 p38 MAP kinase kaskade selvstendig opptrer i epidermis 4. Defekter i enten Ca 2+ signalveien eller i det medfødte immunresponsen vil føre til lavere overlevelse etter såret. Den forholdsvis enkle konstruksjon av C. elegans epidermis, dens genetiske tractability og fordeler for in vivo avbildning gjør det til et utmerket system for å studere flere aspekter av sår reparasjon.
Her presenterer vi protokoller for de to vanligste metodene for såret: nål såret og laser såret. Nål såret krever ingen spesialutstyr (annet enn nålen avtrekker), og med erfaring kan utføres på hundrevis av ormer per dag. Nål såret er utført på dyr som vokser på agarplater. I kontrast er laser såret utført på anesthetized dyr montert på agar pads under et dekkglass, og er egnet for live avbildning av de cellulære responser til skade.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metodene som er presentert her for nålen og laser såret gi komplementære fremgangsmåter for å vurdere muligheten av epidermal epitel for å reparere skaden. Laser såret er relativt lokalisert og (avhengig av laser konfigurasjon) kan være begrenset til epidermis, mens nål såret forstyrrer epidermis, skjellaget, og sannsynlige interne basalmembraner. Nål såret kan mer nøyaktig ligne sår påført av patogener eller mekaniske skader på naturmiljøet. Som regel nål såret krever mer trening for å oppnå presi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Needle wounding methods for C. elegans were first developed by Nathalie Pujol and Jonathan Ewbank; we thank Nathalie Pujol for comments on the manuscript. Work in our laboratory on C. elegans epidermal wound repair is supported by a grant from the NIH to A.D.C. (R01 GM054657).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Plastic Petri plate | Tritech Research | T3308 | 60 mm |
| Levamisole | Sigma | L9756 | 12 mM |
| Borosilicate Glass Capillary | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-2000 | |
| Worm pick (Platinum wire) | Tritech Research | PT-9010 | |
| M9 solution | Home-made | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Sterilize by autoclaving | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | Use 500 ml for 50 worms |
| iQ SYBR Green | Bio-Rad | 1708882 | |
| SuperScript III | Invitrogen | 18080-051 | |
| PCR machine | Bio-Rad | C1000/CFX96 | |
| 96-well PCR tubes | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Image analysis software | Molecular Devices | Metamorph | |
Referências
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Sonnemann, K. J., Bement, W. M. Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 237-263 (2011).
- Xu, S., Chisholm, A. D. A Gαq-Ca2+ signaling pathway promotes actin-mediated epidermal wound closure in C. elegans. Curr Biol. 21, 1960-1967 (2011).
- Pujol, N., et al. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Curr Biol. 18, 481-489 (2008).
- Chisholm, A. D., Xu, S. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. II: differentiation and physiological roles. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 879-902 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook : the online review of C. elegans biology. , 1-11 .
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in cell biology. 48, 225-250 .
- Pujol, N., et al. Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides. PLoS Pathog. 4, (2008).
- Tong, A., et al. Negative regulation of Caenorhabditis elegans epidermal damage responses by death-associated protein kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 1457-1461 (2009).
- Zugasti, O., Ewbank, J. J. Neuroimmune regulation of antimicrobial peptide expression by a noncanonical TGF-beta signaling pathway in Caenorhabditis elegans epidermis. Nat Immunol. 10, 249-256 (2009).
- Zhao, X., et al. Microfluidic chip-based C. elegans microinjection system for investigating cell-cell communication in vivo. Biosensor., & Bioelectronics. 50, 28-34 (2013).
- Jansson, H. B. Adhesion of Conidia of Drechmeria coniospora to Caenorhabditis elegans Wild Type and Mutants. J Nematol. 26, 430-435 (1994).
- Hodgkin, J., Kuwabara, P. E., Corneliussen, B. A novel bacterial pathogen, Microbacterium nematophilum, induces morphological change in the nematode C. elegans. Curr Biol. 10, 1615-1618 (2000).
- Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. Generation of transgenic C. elegans by biolistic transformation. J Vis Exp. (42), (2010).
- Hashmi, S., et al. Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures. BioTechniques. 19, 766-770 (1995).
