Métodos para a pele ferimento e Ensaios para Responses ferida no<em> C. elegans</em
Summary
The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.
Abstract
A C. elegans epiderme e cutícula formar uma camada de pele simples mas sofisticado que pode reparar danos localizados resultante do ferimento. Os estudos da resposta de feridas e reparação neste modelo ter iluminado a nossa compreensão do citoesqueleto e respostas genómicas para danos nos tecidos. Os dois métodos mais comumente usados para ferir a C. elegans pele de um adulto são picadas com agulhas microinjeção, e irradiação com laser local. Agulha ferindo interrompe localmente a cutícula, epiderme, e matriz extracelular associada, e também podem danificar os tecidos internos. Resultados da irradiação com laser em danos mais localizada. Ferimento desencadeia uma sucessão de respostas prontamente ensaiada, incluindo epidérmico elevada Ca 2+ (segundo minutos), a formação e fecho de um anel que contém actina no sítio da ferida (1-2 hr), a transcrição de genes elevada de péptidos antimicrobianos (2-24 hr), e formação de cicatriz. Essencialmente todos os animais adultos de tipo selvagem sobrevivem ferimento, ondecomo mutantes defectivos na reparação de feridas ou outras respostas mostram diminuição sobrevivência. Protocolos detalhados para agulhas e ferimento a laser, e ensaios para a quantificação e visualização de respostas feridas e processos de reparação (dinâmica de Ca, dinâmica de actina, indução peptídeo antimicrobiano e sobrevivência) são apresentados.
Introduction
Pele ferida mecanismos de cura são de interesse biológico básico e relevantes para a saúde humana. Cicatrização de feridas nos animais vertebrados e mamíferos compreende uma série complexa de respostas coordenadas de vários tecidos e de sinalização 1. Muitas simples organismos modelo genético também são capazes de curar feridas de pele 2. É, portanto, de interesse para analisar modelos geneticamente tratáveis de reparação de feridas de pele. Nós e os outros começaram a usar Caenorhabditis elegans como novo modelo para a pele ferida cura 3,4. O objetivo deste protocolo é permitir que um conjunto mais amplo de pesquisadores para usar C. elegans como uma ferramenta para investigar os mecanismos moleculares e celulares da epiderme a cicatrização de feridas.
A C. elegans pele compreende a epiderme (também conhecidos como hipoderme) e a cutícula extracelular 5. A epiderme adultos é formado a partir de um pequeno número de sincícios multinucleados, das quais a maior é a sincício known como hyp7. A epiderme é um epitélio simples que segrega a cutícula na sua superfície apical. A pele pode defender ativamente contra patógenos de penetração na pele e reparar pequenos ferimentos 4. Reparação de feridas do C. elegans pele é robusta, como quase todos os animais do tipo selvagem sobreviver podem sobreviver pequenas perfurações causadas por agulhas, ou danos à pele local provocada pela irradiação laser. C. elegans ferimento da pele desencadeia uma série de respostas, incluindo uma resposta epidérmica imunológica inata, fechamento da ferida, e formação de cicatriz 4. A epiderme adultos é pós-mitótico, e cicatrização de feridas envolve respostas celulares locais em oposição à proliferação epidérmica ou migração celular. Mostrámos que o ferimento da pele provoca um aumento considerável e sustentado epidérmico Ca 2+, exigindo o canal TRPM membrana GTL-2 e internas de Ca 2+ lojas 3. O sinal de Ca2 + da epiderme é necessário para a formação e fecho dos anéis de F-actina no wolocal und. Ferimento também induz resposta imune inata que ativam a transcrição de AMPs como PNL-29. A transcrição induzida pelo ferimento de AMPs é dependente de um / PMK-1 MAP-quinase p38 cascata agindo autonomamente na epiderme 4 TIR-1. Defeitos quer na via de sinalização de Ca2 + ou na resposta imune inata irá conduzir a uma baixa sobrevivência após o ferimento. A estrutura relativamente simples do C. elegans epiderme, sua rastreabilidade genética e as vantagens para a imagem in vivo torná-lo um excelente sistema para estudar vários aspectos da reparação de feridas.
Aqui apresentamos os protocolos para os dois métodos mais comuns de ferimento: ferimento agulha e ferindo laser. Ferimento da agulha requer nenhum equipamento especializado (excepto o puxador de agulha), e com experiência pode ser realizado em centenas de vermes por dia. Ferimento da agulha é realizada em animais em crescimento em placas de agar. Em contraste, o ferimento do laser é realizado em anesanimais thetized montado em agar almofadas sob uma lamela, e é adequada para imagens ao vivo das respostas celulares a danos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os métodos apresentados aqui por agulha e ferimento a laser oferecem abordagens complementares para avaliar a capacidade do epitélio epidérmico para reparar os danos. Ferimento Laser é relativamente localizada e (dependendo da configuração laser) pode ser confinado à epiderme, enquanto ferimento agulha interrompe a epiderme, cutícula e membranas basais internos prováveis. Ferimento Needle pode assemelhar-se com mais precisão as feridas infligidas por patógenos ou danos mecânicos no ambiente natural. Como reg…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Needle wounding methods for C. elegans were first developed by Nathalie Pujol and Jonathan Ewbank; we thank Nathalie Pujol for comments on the manuscript. Work in our laboratory on C. elegans epidermal wound repair is supported by a grant from the NIH to A.D.C. (R01 GM054657).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Plastic Petri plate | Tritech Research | T3308 | 60 mm |
| Levamisole | Sigma | L9756 | 12 mM |
| Borosilicate Glass Capillary | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-2000 | |
| Worm pick (Platinum wire) | Tritech Research | PT-9010 | |
| M9 solution | Home-made | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Sterilize by autoclaving | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | Use 500 ml for 50 worms |
| iQ SYBR Green | Bio-Rad | 1708882 | |
| SuperScript III | Invitrogen | 18080-051 | |
| PCR machine | Bio-Rad | C1000/CFX96 | |
| 96-well PCR tubes | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Image analysis software | Molecular Devices | Metamorph | |
Referências
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