Metoder för Skin såra och Analyser för Wound-svar i<em> C. elegans</em
Summary
The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.
Abstract
Den C. elegans epidermis och nagelband bildar en enkel men sofistikerad hudlagret som kan reparera lokaliserad skada till följd av att såra. Studier av lindade svar och reparation i denna modell har belyst vår förståelse av cytoskelettala och iska reaktioner på vävnadsskada. De två vanligaste metoderna för att såra C. elegans vuxen hud är idioter med mikroinjektion nålar och lokal laserstrålning. Needle såra lokalt stör nagelband, epidermis, och tillhörande extracellulära matrix, och kan även skada inre vävnader. Laserbestrålning resulterar i mer lokala skador. Sårskada utlöser en följd av lätt analyserade responser inklusive förhöjd epidermal Ca2 + (sekunder-minuter), bildning och stängning av en aktin-innehållande ringen vid sårstället (1-2 h), förhöjd transkription av antimikrobiella peptidgener (2-24 hr), och ärrbildning. I huvudsak alla vildtyp vuxna djuren överlever sårskada, därsom mutanter defekta i sårläkning eller andra svar visar minskad överlevnad. Detaljerade protokoll för nål och laser såra, och analyser för kvantifiering och visualisering av lindade svar och reparationsprocesser (Ca dynamik, aktin dynamik, antimikrobiell peptid induktion, och överlevnad) presenteras.
Introduction
Hud sårläkning mekanismer är av grundläggande biologiskt intresse och relevans för människors hälsa. Sårläkning hos vertebrater och däggdjur innefattar en komplex serie samordnade svaren från flera vävnader och signalsystem 1. Många enkla genetiska modellorganismer har också förmåga att läka hudsår 2. Det är därför av intresse att analysera genetiskt lätthanterliga modeller av hudsår reparation. Vi och andra har börjat använda Caenorhabditis elegans som ny modell för huden sårläkning 3,4. Målet med detta protokoll är att möjliggöra en bredare uppsättning forskare att använda C. elegans som ett verktyg för att undersöka molekylära och cellulära mekanismer av epidermal sårläkning.
Den C. elegans huden omfattar epidermis (även känd som huden) och den extracellulära nagelband 5. De vuxna epidermis bildas från ett litet antal multinucleate syncytia, varav den största är den syncytium kNown som hyp7. Epidermis är en enkel epitel som utsöndrar nagelband på sin apikala yta. Huden kan aktivt försvara mot hud-penetrerande patogener och reparera små sår fyra. Wound reparation av C. elegans hud är robust, eftersom nästan alla vildtyp djur överlever kan överleva små sticksår orsakade av nålar, eller lokala hudskador orsakade av laserstrålning. C. elegans huden sårskada utlöser en svit av svaren, inklusive en epidermal medfödda immunsvar, sårtillslutning och ärrbildning 4. De vuxna epidermis är post-mitotiska och sårläkning involverar lokala cellulära svar i motsats till epidermal proliferation eller cellmigration. Vi har visat att huden sårskada utlöser en stor och varaktig ökning av epidermal Ca2 +, kräver membran TRPM kanalen GTL-2 och interna Ca 2 + butiker 3. Den epidermal Ca2 + signal krävs för bildning och nedläggning av F-aktin ringar på wound plats. Såra inducerar också medfödda immunsvar som aktiverar transkriptionen av AMPs såsom NLP-29. Den sårskada-inducerad transkription av AMPs är beroende av en TIR-1 / PMK-1 p38 MAP-kinaskaskad som agerar autonomt i epidermis 4. Defekter i antingen Ca2 + signalväg eller i det medfödda immunsvaret kommer att leda till lägre överlevnad efter sårskada. Den relativt enkla struktur C. elegans epidermis, dess genetiska spårbarhet och fördelar för in vivo imaging gör den till ett utmärkt system för att studera flera aspekter av sårläkning.
Här presenterar vi protokoll för de två vanligaste metoderna för sårskada: nål sårskada och laser sårskada. Needle såra kräver ingen specialutrustning (annat än nålen avdragare), och med erfarenhet kan utföras på hundratals maskar per dag. Needle såra utförs på djur som växer på agarplattor. Däremot är laser såra utförs på Anesthetized djur monterade på agar kuddar under ett täck, och är lämplig för levande avbildning av de cellulära svaren på skador.
Protocol
Representative Results
Discussion
De metoder som presenteras här för nål och laser såra ger kompletterande tillvägagångssätt för att bedöma förmågan hos epidermal epitel att reparera skador. Laser såra är relativt lokal och (beroende på laserkonfiguration) kan begränsas till epidermis, medan nålen såra stör epidermis, nagelband och sann interna basalmembraner. Needle såra får mer exakt likna sår orsakade av patogener eller mekaniska skador i naturen. Som regel kräver nål såra mer övning för att uppnå exakta sår som är kompat…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Needle wounding methods for C. elegans were first developed by Nathalie Pujol and Jonathan Ewbank; we thank Nathalie Pujol for comments on the manuscript. Work in our laboratory on C. elegans epidermal wound repair is supported by a grant from the NIH to A.D.C. (R01 GM054657).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Plastic Petri plate | Tritech Research | T3308 | 60 mm |
| Levamisole | Sigma | L9756 | 12 mM |
| Borosilicate Glass Capillary | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-2000 | |
| Worm pick (Platinum wire) | Tritech Research | PT-9010 | |
| M9 solution | Home-made | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Sterilize by autoclaving | |
| Trizol | Invitrogen | 15596026 | Use 500 ml for 50 worms |
| iQ SYBR Green | Bio-Rad | 1708882 | |
| SuperScript III | Invitrogen | 18080-051 | |
| PCR machine | Bio-Rad | C1000/CFX96 | |
| 96-well PCR tubes | Bio-Rad | MLL9601 | |
| Image analysis software | Molecular Devices | Metamorph | |
Referências
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453, 314-321 (2008).
- Sonnemann, K. J., Bement, W. M. Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 237-263 (2011).
- Xu, S., Chisholm, A. D. A Gαq-Ca2+ signaling pathway promotes actin-mediated epidermal wound closure in C. elegans. Curr Biol. 21, 1960-1967 (2011).
- Pujol, N., et al. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Curr Biol. 18, 481-489 (2008).
- Chisholm, A. D., Xu, S. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. II: differentiation and physiological roles. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 879-902 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook : the online review of C. elegans biology. , 1-11 .
- Bargmann, C. I., Avery, L. Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in cell biology. 48, 225-250 .
- Pujol, N., et al. Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides. PLoS Pathog. 4, (2008).
- Tong, A., et al. Negative regulation of Caenorhabditis elegans epidermal damage responses by death-associated protein kinase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 1457-1461 (2009).
- Zugasti, O., Ewbank, J. J. Neuroimmune regulation of antimicrobial peptide expression by a noncanonical TGF-beta signaling pathway in Caenorhabditis elegans epidermis. Nat Immunol. 10, 249-256 (2009).
- Zhao, X., et al. Microfluidic chip-based C. elegans microinjection system for investigating cell-cell communication in vivo. Biosensor., & Bioelectronics. 50, 28-34 (2013).
- Jansson, H. B. Adhesion of Conidia of Drechmeria coniospora to Caenorhabditis elegans Wild Type and Mutants. J Nematol. 26, 430-435 (1994).
- Hodgkin, J., Kuwabara, P. E., Corneliussen, B. A novel bacterial pathogen, Microbacterium nematophilum, induces morphological change in the nematode C. elegans. Curr Biol. 10, 1615-1618 (2000).
- Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. Generation of transgenic C. elegans by biolistic transformation. J Vis Exp. (42), (2010).
- Hashmi, S., et al. Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures. BioTechniques. 19, 766-770 (1995).
