Fremstilling af rotteserum Egnet til pattedyr Hele Embryo Culture

Summary

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Abstract

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Introduction

En række af model-dyr anvendes i udviklingsmæssige biologi til at undersøge udviklingsmæssige mekanismer på det molekylære og cellulære niveau. For eksempel har padder og fuglearter i vid udstrækning blevet anvendt som klassiske model dyr, der er egnet til direkte manipulation af embryoner, fordi disse embryoer udvikler uden for moderen. I modsætning til disse dyr, pattedyr embryoner vokse i livmoderen af ​​moderen, og væksten på senere stadier er helt afhængig af den funktion af livmoderen. Derfor er det typisk vanskeligt direkte at manipulere mammale embryoer, såsom dem fra mus og rotter i tidlige stadier. I 1960'erne Denis Ny etableret et pattedyr hel embryo kultur (WEC) teknik ved hjælp WEC apparater med en konstant forsyning ilt og varme kontrol ^1.. I WEC kan muse-og rotte-embryoner vokse ex vivo (dvs. uden for livmoderen). Selv WEC teknik ofte blev brugt i teratologi ved at tilføje forskellige chemical forbindelser i dyrkningsmediet, denne teknik er også blevet brugt i forskellige udviklingsmæssige biologiske undersøgelser for at undersøge unikke udviklingsmæssige mekanismer i pattedyr ^2-4. For eksempel er WEC kombineres med andre teknikker, såsom cellemærkning, i vildtype-og mutant embryoner ved hjælp af fluorescerende farvestof ^5, celletransplantation ⁶ og genindførsel via lipofektion ⁷ og elektroporation ^8-13.

For nylig er in utero manipulation blevet anvendt til at analysere udviklingsprocesser i gnavere embryoner på senere stadier og er blevet kombineret med elektroporeringsteknikker ^14-16. Men disse teknikker er ikke egnede til manipulation af implantation og midgestation embryoner grund vanskeligt ved at opnå nøjagtig lokal injektion af DNA-opløsningen i embryoner i de tidlige faser. Selvom ultralyd-vejledt celle transplantation og injektion af virale vektorer i tidlige embryoner (dvs., E8.5-E-9.5 i mus) i livmoderen er blevet rapporteret tidligere ^17,18, er fremragende færdigheder, der kræves for at udføre disse eksperimenter med en høj succesrate. Derfor WEC med høj tilgængelighed ex vivo har fordele med hensyn til manipulation af muse-og rotte-embryoner.

Umiddelbart centrifugeret (IC) rotteserum fremstillet ud fra hanrotter anvendes ofte til WEC medium. Når embryoner dyrkes på implantation etape (dvs. tidligere end E8.0 i musen eller E10.0 i rotte), er en blanding af syntetisk medium og IC rotteserum ofte brugt som et medium for WEC ^19. Men for at kultur embryoner på midten af drægtigheden (dvs.., E8.0-12.5 i mus embryoner eller E10.0-E14.5 i rotte embryoner), 100% serum bør anvendes som et medium, fordi der ikke i øjeblikket tilgængelige alternativ medier giver embryoner til at vokse normalt in vitro i mere end 2 dage.

Fremstillingen af ​​høj kvalitet rotteserum eret afgørende skridt for at opnå reproducerbarhed i WEC eksperimenter. Sammenlignet med forsinket centrifugering, IC har den fordel at reducere hæmolyse når serum opsamles ved at klemme fibrinkoaglet fordi de fleste af de røde blodlegemer er allerede blevet adskilt fra fibrinkoagulat. Som hæmolytisk rotteserum undlader at støtte den normale vækst af rotter og mus embryoner, udarbejdelse af serum ved hjælp af øjeblikkelig centrifugering er at foretrække frem for forberedelse hjælp forsinket centrifugering. Vores protokol indeholder to yderligere trin i forhold til andre protokoller, ^18-20 (dvs.., Lagring tappet blod på is før den første centrifugering og opretholdelse af de indsamlede blodprøver i 2 timer ved 4 ° C efter den første centrifugering). Den tidligere trin kan forsinke dannelse af blodprop, og sidstnævnte trin fremmer størkning af fibrinkoagel let klemning. Derfor kan vores protokol anvendes af begyndere. Men gengivelse blodtapning og serumudvinding nøjagtigt ved blot at henvise til protokol bøger er yderst vanskeligt ^19-21. I denne video artikel vil vi vise vores standard protokol for udarbejdelse af optimale IC rotte serum, som omfatter indsamling af blod fra den abdominale aorta hos hanrotter og udvinding af serum ved centrifugering.

Protocol

BEMÆRK: Dyreforsøg er udført i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Udvalget for dyreforsøg i Tohoku University School of Medicine godkendt de eksperimentelle procedurer, der er beskrevet heri. 1. Anæstesi og Laparotomi For tapning anvende specifikke patogenfrie Sprague-Dawley rotter. Fast rotterne i mindst 18 timer, samtidig med at vand. Brug pensionerede mandlige opdrætter rotter …

Representative Results

Figur 1 viser repræsentative resultater af de beskrevne procedurer til separation af blodceller og serum. Vi typisk opnå 15 ml blod fra en pensioneret hanrotte (figur 1A). Ved centrifugering, kan det opsamlede blod adskilles i et øvre lag, der indeholder serum og fibrinklynge, der er angivet med en pil og et nedre lag, der indeholder blodlegemer (figur 1C). Vigtigt er det, kan blodprøver hæmolytiske ikke adskilles i serum og blod lag (figur 1b). Ef…

Discussion

Reproducerbare resultater i WEC eksperimenter er afhængige af anvendelsen af høj kvalitet IC rotteserum og nøjagtig embryo dissektion teknik ^3. Må ikke forkorte perioden for fastende før indsamling af blod, fordi fasten er nødvendigt at standardisere glucosekoncentrationer i blodet. Hunrotter bør ikke anvendes til fremstilling af serum fordi hormonniveau ændring i hundyr ifølge estrale cyklus, og sådanne ændringer i østradiol hormoner er uegnede til embryo kulturer. Desuden bør ekstremt fede hanr…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Isoflurane	Abbott	B506	For anesthesia of rats.
Large scissors	Napox	B-7H	Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats.
Curved forceps	Napox	A-3-2	Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot.
Sprague-Dawley (SD) rat	Charles Rivers Laboratories		Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats.
Syringe (20 ml)	TERUMO	SS-29ESZ
Needle (21G x 5/8")	TERUMO	NN-2116R
Sterile test (spitz) tube (10 ml)	ASIAKIZAI	1101C000B-10	For collection of boold
Sterile disposable pipette	Eiken Chemical	CD2000 No.4
Sterilie disposable tube (15 ml)	Falcon	2196