स्तनधारी पूरे भ्रूण संस्कृति के लिए उपयुक्त चूहा सीरम की तैयारी
Summary
Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.
Abstract
Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.
Introduction
मॉडल कई प्रकार के जानवर आणविक और सेलुलर स्तर पर विकास तंत्र की जांच करने के लिए विकासात्मक जीव विज्ञान में किया जाता है. उदाहरण के लिए, उभयचर और एवियन प्रजातियों व्यापक रूप से इन भ्रूण मां के बाहर विकसित क्योंकि भ्रूण की प्रत्यक्ष हेरफेर के लिए उपयुक्त हैं कि शास्त्रीय मॉडल जानवरों के रूप में इस्तेमाल किया गया है. इन जानवरों के विपरीत, स्तनधारी भ्रूण मां के गर्भाशय में बढ़ती है, और बाद के चरणों में वृद्धि गर्भाशय के समारोह पर महत्वपूर्ण निर्भर है. इसलिए, यह सीधे ऐसे प्रारंभिक दौर में माउस और चूहा से उन जैसे स्तनधारी भ्रूण हेरफेर करने के लिए आम तौर पर मुश्किल है. 1960 के दशक में, डेनिस न्यू एक निरंतर ऑक्सीजन की आपूर्ति और गर्मी नियंत्रण के साथ 1 WEC apparatuses का उपयोग कर एक स्तनधारी पूरे भ्रूण संस्कृति (WEC) तकनीक की स्थापना की. WEC में, माउस और चूहा भ्रूण पूर्व vivo, (यानी, गर्भाशय के बाहर) विकसित कर सकते हैं. WEC तकनीक अक्सर विभिन्न chemic जोड़कर टेरटालजी में इस्तेमाल किया गया था हालांकिअल, संस्कृति के माध्यम में यौगिकों इस तकनीक को भी स्तनधारियों 2-4 में अद्वितीय विकास तंत्र की जांच करने के लिए विभिन्न विकासात्मक जीव विज्ञान के अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है. उदाहरण के लिए, WEC फ्लोरोसेंट डाई 5, कोशिका प्रत्यारोपण 6, और lipofection 7 और electroporation 8-13 के माध्यम से जीन परिचय का उपयोग करके जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती भ्रूण में इस तरह के सेल लेबलिंग जैसे अन्य तकनीकों के साथ संयुक्त है.
हाल ही में, गर्भाशय हेरफेर में बाद के चरणों में कृंतक भ्रूण में विकास की प्रक्रिया का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और electroporation तकनीक 14-16 के साथ संयुक्त कर दिया गया है. हालांकि, इन तकनीकों के प्रारंभिक दौर में भ्रूण में डीएनए समाधान के सटीक स्थानीय इंजेक्शन प्राप्त करने की कठिनाइयों के कारण postimplantation और midgestation भ्रूण के हेरफेर के लिए उपयुक्त नहीं हैं. हालांकि जल्दी भ्रूण (में अल्ट्रासाउंड निर्देशित कोशिका प्रत्यारोपण और वायरल वैक्टर इंजेक्शन यानी, E8.5-E-9.5 माउस में) utero में पहले से 17,18, उत्कृष्ट कौशल के लिए एक उच्च सफलता दर के साथ इन प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक हैं सूचित किया गया है. इसलिए, उच्च पहुँच पूर्व vivo साथ WEC माउस और चूहा भ्रूण के हेरफेर के लिए सम्मान के साथ फायदे हैं.
नर चूहों से तैयार तुरंत centrifuged (आईसी) चूहा सीरम अक्सर WEC माध्यम के लिए प्रयोग किया जाता है. भ्रूण (चूहे में माउस या E10.0 में E8.0 से पहले यानी,) postimplantation स्तर पर संवर्धित कर रहे हैं, सिंथेटिक मध्यम और आईसी चूहा सीरम का एक मिश्रण अक्सर WEC 19 के लिए एक माध्यम के रूप में प्रयोग किया जाता है. कोई वर्तमान में उपलब्ध वैकल्पिक मीडिया की अनुमति देता है, क्योंकि हालांकि, मध्य गर्भ में संस्कृति भ्रूण को (यानी., E8.0-12.5 माउस भ्रूण या चूहा भ्रूण में E10.0-E14.5 में), 100% सीरम एक माध्यम के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए अधिक से अधिक 2 दिनों के लिए इन विट्रो में सामान्य रूप से विकसित करने के लिए भ्रूण.
उच्च गुणवत्ता वाले चूहे सीरम की तैयारी हैWEC प्रयोगों में reproducibility को प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है. देरी centrifugation की तुलना में, आईसी लाल रक्त कोशिकाओं के अधिकांश पहले से ही आतंच थक्का से अलग हो गया है क्योंकि सीरम आतंच थक्का फैलाएंगे द्वारा एकत्र की है जब रक्तापघटन को कम करने का लाभ दिया है. रक्तलायी चूहा सीरम चूहा और माउस भ्रूण की सामान्य वृद्धि का समर्थन करने में विफल रहता है, के रूप में तत्काल centrifugation का उपयोग सीरम की तैयारी में देरी centrifugation का उपयोग तैयारी के लिए बेहतर है. हमारे प्रोटोकॉल अन्य प्रोटोकॉल की तुलना में दो अतिरिक्त चरणों में हैं 18-20 (यानी., पूर्व पहले centrifugation के लिए बर्फ पर एकत्र रक्त भंडारण और पहले centrifugation के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए एकत्र रक्त के नमूनों को बनाए रखने). पूर्व कदम खून का थक्का के गठन में देरी कर सकते हैं, और बाद के कदम आसान फैलाएंगे के लिए आतंच थक्का के solidification को बढ़ावा देता है. इसलिए, हमारे प्रोटोकॉल शुरुआती द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, reproducing रक्त संग्रह और सीरमबस प्रोटोकॉल पुस्तकों का हवाला देते हुए सही निकासी 19-21 बेहद मुश्किल है. इस वीडियो लेख में, हम नर चूहों और centrifugation द्वारा सीरम की निकासी के उदर महाधमनी से रक्त संग्रह में शामिल हैं जो इष्टतम आईसी चूहा सीरम, की तैयारी के लिए हमारे मानक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
WEC प्रयोगों में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों उच्च गुणवत्ता आईसी चूहा सीरम और सही भ्रूण विच्छेदन तकनीक 3 के उपयोग पर निर्भर हैं. उपवास रक्त में ग्लूकोज सांद्रता मानकीकृत करने के लिए आवश्?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. Hajime Ichijo for video recording and helpful advice concerning editing the video. We also thank the Osumi lab members for animal care. This work is supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Area, Neural Diversity and Neocortical Organization, from MEXT of Japan (to N. O.). T. K. was supported by a Research Fellowship of JSPS for Young Scientists.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Isoflurane | Abbott | B506 | For anesthesia of rats. |
| Large scissors | Napox | B-7H | Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats. |
| Curved forceps | Napox | A-3-2 | Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot. |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Charles Rivers Laboratories | Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats. | |
| Syringe (20 ml) | TERUMO | SS-29ESZ | |
| Needle (21G x 5/8") | TERUMO | NN-2116R | |
| Sterile test (spitz) tube (10 ml) | ASIAKIZAI | 1101C000B-10 | For collection of boold |
| Sterile disposable pipette | Eiken Chemical | CD2000 No.4 | |
| Sterilie disposable tube (15 ml) | Falcon | 2196 |
Referências
- New, D. A. T., Copp, A. J., Cockroft, D. L. Introduction. Mammalian Postimplantation Embryos. A Practical Approach. , 1-14 (1990).
- Eto, K., Takakubo, F. Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis. J Craniofac Genet Dev Biol. 5, 351-355 (1985).
- Takahashi, M., Osumi, N. The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system. J Vis Exp. (42), e2170 (2010).
- New, D. A. Whole embryo culture, teratogenesis, and the estimation of teratologic risk. Teratology. 42, 635-642 (1990).
- Matsuo, T., et al. A mutation in the Pax-6 gene in rat small eye is associated with impaired migration of midbrain crest cells. Nat Genet. 3, 299-304 (1993).
- Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5. Development. 133, 1335-1345 (2006).
- Yamamoto, M., et al. Nodal antagonists regulate formation of the anteroposterior axis of the mouse embryo. Nature. 428, 387-392 (2004).
- Inoue, T., et al. Role of cadherins in maintaining the compartment boundary between the cortex and striatum during development. Development. 128, 561-569 (2001).
- Takahashi, M., Osumi, N. Pax6 regulates specification of ventral neurone subtypes in the hindbrain by establishing progenitor domains. Development. 129, 1327-1338 (2002).
- Calegari, F., Haubensak, W., Yang, D., Huttner, W. B., Buchholz, F. Tissue-specific RNA interference in postimplantation mouse embryos with endoribonuclease-prepared short interfering RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14236-14240 (2002).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev Growth Differ. 50, 485-497 (2008).
- Pryor, S. E., Massa, V., Savery, D., Greene, N. D., Copp, A. J. Convergent extension analysis in mouse whole embryo culture. Methods Mol Biol. 839, 133-146 (2012).
- Kikkawa, T., et al. Dmrta1 regulates proneural gene expression downstream of Pax6 in the mammalian telencephalon. Genes Cells. 18, 636-649 (2013).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurociência. 103, 865-872 (2001).
- Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294, 1071-1074 (2001).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Turnbull, D. H. Ultrasound backscatter microscopy of mouse embryos. Methods Mol Biol. 135, 235-243 (2000).
- Pierfelice, T. J., Gaiano, N. Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5. J Vis Exp. (45), e2047 (2010).
- Quinlan, G. A., Khoo, P. L., Wong, N., Trainor, P. A., Tam, P. P. Cell grafting and labeling in postimplantation mouse embryos. Methods Mol Biol. 461, 47-70 (2008).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R., Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R. Roller culture of postimplantation embryos. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , 237-241 (2003).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 391-393 (2011).
- Brown-Woodman, P. D., Ritchie, H. E., Korabelnikoff, A., Emmanuel, C. Replacement of ether with alternate volatile anesthetics for collection of rat serum used in embryo culture. Toxicol In Vitro. 18, 719-724 (2004).
- Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J Vis Exp. (56), e3132 (2011).
- Machado, C. B., et al. Reconstruction of phrenic neuron identity in embryonic stem cell-derived motor neurons. Development. 141, 784-794 (2014).
- Glanville-Jones, H. C., Woo, N., Arkell, R. M. Successful whole embryo culture with commercially available reagents. Int J Dev Biol. 57, 61-67 (2013).
- Ornoy, A., Yacobi, S., Yaffee, P. A simple method of culture of 11.5-day-old rat embryos in DMEM/F12 and 20% fetal bovine serum. J Anat. 203, 419-423 (2003).
- Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System. J Vis Exp. (85), e50308 (2014).
