La manipulación de la murino Glándula Lagrimal
Summary
La glándula lagrimal (LG) es un órgano de ramificación que produce los componentes acuosos de lágrimas necesarias para el mantenimiento de la visión y la salud ocular. Aquí describimos murino LG disección y ex vivo las técnicas de cultivo de descifrar las vías de señalización implicadas en el desarrollo de LG.
Abstract
La glándula lagrimal (LG) segrega lágrimas acuosas necesarias para mantener la estructura y la función de la córnea, un tejido transparente esencial para la visión. En el ser humano una sola LG reside en la órbita sobre el extremo lateral de cada ojo la entrega de lágrimas a la superficie ocular a través de 3 – 5 conductos. El ratón tiene tres pares de glándulas oculares, el más estudiado de los cuales es la glándula lagrimal exorbital (LG) situado anterior y ventral de la oreja. Similar a otros órganos glandulares, el LG desarrolla a través del proceso de morfogénesis epitelial de ramificación en el que un solo brote epitelial dentro de un mesénquima condensado se somete a múltiples rondas de brote y la formación del conducto para formar una red interconectada intrincada de los acinos y conductos de secreción. Este elaborado proceso ha sido bien documentado en muchos otros órganos epiteliales, tales como el páncreas y la glándula salival. Sin embargo, el LG ha sido mucho menos explorada y los mecanismos que controlan la morfogénesis son mal bajoresistido. Tenemos la sospecha de que esta falta de representación como un sistema modelo es una consecuencia de las dificultades relacionadas con la búsqueda, la disección y el cultivo de la LG. Por lo tanto, aquí se describen técnicas de disección de embriones cosecha y post-natal LG y métodos de cultivo ex vivo de los tejidos.
Introduction
La glándula lagrimal (LG) es responsable de la secreción de lágrima acuosa crítica para la agudeza visual y la salud, el mantenimiento y la protección de las células de la superficie ocular. LG resultados disfunción en uno de los trastornos oculares más comunes y debilitantes: acuoso deficiente en seco de Enfermedades de los ojos, que se caracteriza por la irritación ocular, sensibilidad a la luz y la disminución de la visión 1. En el ser humano la LG reside en la órbita por encima del extremo lateral del ojo donde 3 – 5 excretores lágrimas de depósito conductos sobre la superficie ocular. El ratón tiene tres pares de glándulas oculares, el más estudiado de los cuales es la glándula lagrimal (LG) situado anterior y ventral de la oreja (exorbital) con lágrimas que viajan al ojo a través de un solo conducto excretor. Similar a otros órganos glandulares, el LG desarrolla a través del proceso de morfogénesis epitelial de ramificación en el que un solo brote epitelial dentro de un mesénquima condensado se somete a múltiples rondas de brote y la formación del conducto a parasoy una intrincada red interconectada de acinos y conductos de secreción (Figura 1) 2. Durante el desarrollo del epitelio se vasculariza, así como en gran medida inervado por los nervios parasimpáticos del ganglio pterigopalatina y en menor medida por los nervios simpáticos del ganglio cervical superior 3. Las interacciones entre cada uno de estos tipos de células es decir, células neuronales, epiteliales, endoteliales y mesenquimales, son esenciales para la función y el mantenimiento del tejido adulto. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes de coordinación de desarrollo LG y regeneración, así como la forma en guías de comunicación de tipo de células entre estos procesos sigue siendo poco clara.
El advenimiento de las embrionarias ex vivo las técnicas de cultivo ha permitido la identificación de las vías de desarrollo y regenerativos en múltiples órganos de ramificación 4. El cultivo ex vivo da el investigador la capacidad de manipular el órgano (memecánico, genético o químico) bajo condiciones definidas, así como para caracterizar el desarrollo de órganos y las interacciones célula-célula en tiempo real. El LG exorbital del ratón es altamente susceptible a esta técnica y estudios recientes han definido sistemas que regulan su desarrollo 2,5 señalización. Sin embargo, a pesar de la necesidad de comprender las señales moleculares que sustentan el desarrollo de LG y la regeneración, en la actualidad sigue siendo poco estudiada, probablemente debido a las dificultades técnicas para aislar el órgano. En este trabajo se describe cómo aislar y llevar a cabo el cultivo ex vivo de la embrionaria murina LG para definir los programas de desarrollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La versatilidad de la cultura y manipular el LG ex vivo ofrece ventajas significativas para el estudio de su desarrollo. Esto incluye la velocidad a la cual el investigador es capaz de probar las hipótesis y la multitud de las perturbaciones que se pueden realizar para evaluar cómo epitelial, neuronal, endotelial y células mesencyhmal interactúan para formar el órgano. Sin embargo, hay una serie de advertencias cuando se utiliza este modelo. En primer lugar, en virtud de su aislamiento de la glándula ya n…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer el financiamiento proporcionado por el Programa de Asignación de Recursos de la UCSF.
Materials
| Name | Catalog #. | Company | Comments/Description |
| DMEM/F12 without HEPES | SH3027101 | Thermo Scientific | |
| Penicillin-Streptomycin | P0781 | Sigma-Aldrich | |
| Albumin solution from bovine serum | A9576 | Sigma-Aldrich | |
| Paraformaldehyde 16% Solution | 15710 | Electron Microscopy Sciences | Diluted to 4% in 1X PBS |
| Phosphate Buffered Saline 10X | BP665-1 | Fisher Scientific | |
| Phosphate Buffered Saline 1X | Prepared from 10X stock | ||
| holo-Transferrin bovine | T1283 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL. |
| L- Ascorbic acid (Vitamin C) | A4544 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 ug/mL. |
| BioLite 100mm Tissue Culture Treated Dishes | 130182 | Thermo Scientific | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo Microscope with substage iluminator | Stemi 2000 | Carl Zeiss | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| Substage Illuminator Base for Stereo Microscope | TLB 4000 | Diagnostics Instruments, Inc. | |
| Falcon 35mm Tissue Culture Treated Dishes | 353001 | Corning | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50mm uncoated glass bottom dishes | P50G-1.5-14-F | MatTek Corporation | |
| Widefield fluorescence microscope | Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal Microscope | TCS SP5 | Leica Microsystems | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| Ideal for harvesting glands from embryos | |||
| SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2cm) | 17-305X | Integra LifeSciences Corporation | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11cm) | 91150-20 | Fine Science Tools (USA), Inc. | Ideal for harvesting glands from embryos |
| Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3. | 4-30 | Integra LifeSciences Corporation | |
| Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10 | 4-310 | Integra LifeSciences Corporation | |
| RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit | AM1931 | Life Technologies | |
| Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I | 3446-005-01 | Trevigen | 6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12 |
| Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 um pre size, 13mm | 110405 | Whatman | |
| Timed-pregnant Pax6-Cre,GFP mice | Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr | The Jackson Laboratory | Optional mice for learning how to locate the LG. |
Referências
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