Imaging Intracellulær Ca²⁺ Signaler i striatale Astrocytter fra voksne mus Bruke genetisk kodet Kalsium Indikatorer

Summary

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca²⁺ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca²⁺ signals within striatal astrocytes in situ.

Abstract

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca²⁺ concentration fluctuations ([Ca²⁺]_i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca²⁺]_i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca²⁺]_i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca²⁺]_i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca²⁺]_i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca²⁺]_i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca²⁺]_i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca²⁺]_i signals in the striatal microcircuitry.

Introduction

Astrocytter er allestedsnærværende og rikelig glialceller i hjernen. Det er godt etablert at astrocytter tjener avgjørende støtte og homeostatiske roller, inkludert bufring av K ⁺ konsentrasjon i det ekstracellulære rom, opptak av nevrotransmittere, så vel som å gi næringsstoffer. Men nyere studier viser at de også vise [Ca ^2+] _Jeg signaler, som oppstår spontant og er økt med nerveaktiviten ^en. Eksistensen av astrocyte [Ca ^2+] _i signalering har blitt stadig tenkt å utløse sin kommunikasjon med nerveceller, og som sådan har blitt tolket som en form for "Ca ²⁺ oppstemthet" innenfor astrocytter. De tilgjengelige data over de siste to tiårene foreslår to innstillinger der astrocytter og nevroner kan kommunisere, kanskje i en toveis måte. Først, astrocytter ofte reagere med en økning i [Ca2 _^+] når den aktiveres av nevrotransmittere ognevromodulatorer løslatt fra nevroner ^to. For det andre, [Ca ^2+] _Jeg øker i astrocytter føre til utslipp av signalmolekyler fra astrocytter som i sin tur kan påvirke nerveceller og blodårer. Tyder på at molekyler løslatt fra astrocytter føre til endringer i funksjonene til synapser, kretser og til slutt adferd ^3-5 via astrocyte-til-nevron signalering. Men, dette er fortsatt en rask utvikling forskningsområde, og det har blitt hevdet at en bedre og detaljert forståelse av astrocyte [Ca ^2+] _Jeg er nødvendig for å løse noen av dagens usikkerhet ^6.

I tidligere arbeid, ble det vist at ilegging av organiske Ca ²⁺ indikatorfarger i astrocytter unnlater å pålitelig oppdage [Ca ^2+] _Jeg signaler i hele astrocytter i kultur og in situ ^7-10. Disse funnene har vært diskutert av oss og andre ^6,11,12. Den lønnsommg bildet er at [Ca ^2+] _Jeg signaler innenfor astrocyttkulturer prosesser (f.eks, greiner og branchlets), som er de primære områder for samhandling med nevroner og blodårer, har sjelden blitt utforsket i detalj. Nylig har anvendelsen av genetisk kodede kalsium indikatorer (GECIs) som cytosolisk GCaMP3, GCaMP5G og GCaMP6 og plasmamembran forankrede versjoner (f.eks, Lck-GCaMP3) har tillatt studiet av [Ca2 _^+] signaler i små avdelinger av astrocytter slike som tynne prosesser, nær plasmamembranen, og i løpet av hele områder ^7,8. Imidlertid GECIs har en ulempe i løpet av organiske Ca ^{2 +} indikatorfargestoffer, og som er kravet til genetiske metoder for å levere de kodende genene selektivt til astrocytter in vivo i perioder på uker for GECIs å være hensiktsmessig uttrykt. Expression in vivo er vanligvis oppnås ved hjelp av transgene mus, knock-in mus eller med virus basert levering appKakerlakker. I den foreliggende Jove artikkelen rapporterer vi metoder og prosedyrer som brukes til å levere GECIs til striatale astrocytter hjelp adenoassosiert virus. Vi fokuserer på cytomegalovirus-GCaMP3 som et eksempel, men den samme grunnleggende prosedyren fungerer for hvilken som helst annen GECI eller fluorescerende protein basert reporter.

Protocol

Alle dyre protokoller var i samsvar med det amerikanske National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, og ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved UCLA. 1.1) Forbered Mikropipette og AAV2 / 5 Virus Loading Bruk tynne borsilikatglass mikropipetter for injeksjon av viruset. Trekk mikropipette ved hjelp av en to-trinns trekking program med en vertikal avtrekker. Fas pipetten i en vinkel på 40 ° ved hjelp av en pipette kvern. Pipetten som …

Representative Results

For astrocytt spesifikk ekspresjon av cytomegalovirus-GCaMP3 i striatum, brukte vi adenoassosiert virus (AAV) av serotype 5, og GFAP GfaABC 1 D-promoteren (figur 1A), som tidligere er blitt vist til å drive robust GCaMP3 og reportergen uttrykk i hippocampus og kortikale astrocytter 8,14. To uker etter virusmikroinjeksjon i mus-striatum, ble musen (~ 10 uker gamle) og perfundert IHC ble utført på tynne hjerneseksjoner for å evaluere cytomegalovirus-GCaMP3 ekspresjon i striatum <…

Discussion

Metodene som er beskrevet her har tillatt oss å uttrykke CYTO-GCaMP3 i striatale astrocytter in vivo for påfølgende [Ca ^2+] _i bildebehandling i situ. Denne metoden har fordeler fremfor å bruke transgene eller knock-in mus, inkludert robust uttrykk for målrettet protein, hurtighet og fleksibilitet av eksperimentell implementering og anatomisk spesifisitet. Ekspresjonen av GCaMP3 ved hjelp AAV2 / 5 ble funnet å være spesifikk og robust. Kombinasjonen av GFAP GfaABC _1</su…

Materials

Syringe Pump	Harvard Apparatus	704506
Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100-4
Micropipette puller	Narishige	PC-10
Micropipette grinder	Narishige	EG-40
pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3	Addgene	44331	a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging
I mL syringe	BD	309628
syringe needle	BD	305109
AAV2/5 virus	UPenn vector core	NA
Sudan red IV	Sigma-Aldrich	67386
Mineral oil	CVS Pharmacy	152355
Cryostat	Leica	CM3050 S
Stereotaxic instrument	David Kopf Instruments	900LS
High Speed Rotary Micromotor Kit	FOREDOM	K.1070
Paraformaldehyde	Santa cruz biotechnology	sc-281692
Super Glue	Krazy®Glue	KG925
Microslicer	Ted Pella	DTK-Zero 1
Confocal microscopes	Olympus	FV300 and FV1000
Normal goat serum	Vector	S-1000
chicken anti-GFP	Abcam	ab13970
mouse anti-s100β	Sigma-Aldrich	S2532
mouse anti-NeuN	Millipore	MAB377
mouse anti-glutamine synthetase	Millipore	MAB302
goat anti-mouse-Alexa546	Invitrogen	A11003
goat anti-chicken-Alexa488	Invitrogen	A11039
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Cover Glass	Fisher Scientific	12-548-5J
Mounting Medium	Vector	H-1000