Erhvervelse af højkvalitets digital video af<em> Drosophila</em> Larvestadiet og voksne opførsel fra en Lateral Perspektiv
Summary
Her beskriver vi en enkel og bredt tilgængelig mikroskopi teknik til at erhverve digital video af Drosophila voksen og larvernes mutant fænotyper af høj kvalitet fra en lateral perspektiv.
Abstract
Drosophila melanogaster er en kraftig eksperimentel model for undersøgelse af funktionen af nervesystemet. Genmutationer, der forårsager dysfunktion af nervesystemet ofte producere levedygtige larver og voksne, der har bevægelseskomponenter defekte fænotyper der er vanskelige at tilstrækkeligt beskrive med tekst eller fuldstændigt repræsentere en enkelt fotografisk billede. Nuværende former for videnskabelig publicering, støtter imidlertid indsendelse af digital video medier som supplerende materiale til at ledsage et manuskript. Her beskriver vi en enkel og bredt tilgængelig mikroskopi teknik til at erhverve digital video af både Drosophila larvestadiet og voksne fænotyper af høj kvalitet fra en lateral perspektiv. Video af larve og voksen bevægelse fra en side-view er fordelagtig, fordi det giver mulighed for observation og analyse af subtile forskelle og variationer i afvigende lokomotiv adfærd. Vi har med succes anvendt teknik til at visualisere og kvantificere aberrant crawling adfærd i tredje stadie larver, foruden voksne mutant fænotyper og adfærd, herunder grooming.
Introduction
Den fælles bananflue Drosophila melanogaster er en kraftig eksperimentel model for undersøgelse af funktionen af nervesystemet 1-3. Evolutionær bevaring af struktur og funktion af nervesystemet med mennesker, samt lette genmanipulation og en bred vifte af genetiske værktøjer gør Drosophila premieren organisme at modellere menneskelig neurodegenerative sygdomme 4. Genmutationer, der forårsager dysfunktion af nervesystemet ofte resultere i levedygtig mutant larver og voksne Drosophila med nedsat bevægelse. Fænotyper observeret i nervesystem mutanter omfatter nedsat bevægelse, afvigende koordinering og spastiske bevægelser i voksne, såvel som underskud i peristaltisk sammentrækning af kroppen væg muskulatur, og delvis lammelse af larver. Disse fænotyper er blevet udnyttet i udviklingen af højt gennemløb genetiske skærme og bevægelseskomponenter assays af mutant larver 56 og voksen 7-10 Drosophila formål at kvantificere bevægelse nyrefunktion og identificere gener, der er nødvendige for funktionen af nervesystemet. Mens disse metoder er særdeles nyttige til at kvantificere larvestadiet og voksne lokomotiv adfærd, de undlader at formidle kvalitative oplysninger om hver enkelt afvigende adfærd. For eksempel, mens mutant tredje stadie larver kan udvise ændrede bevægelseskomponenter parametre i en adfærdsmæssig analyse, kan det være uklart, om dette er resultatet af ændringer i rytmiske peristaltiske sammentrækninger i løbet af kravlende cyklus, generel mangel på koordinering, eller delvis lammelse af den bageste krop væg muskulatur. Her beskriver vi en enkel og bredt tilgængelig mikroskopi teknik til at erhverve digital video af Drosophila voksen og larvestadiet lokomotiv fænotyper af høj kvalitet fra en lateral perspektiv. Digital video erhvervet fra en lateral perspektiv tillader direkte observation og analyse af subtile sondringer i Locomotive adfærd fra en mere informativ side-view orientering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila melanogaster 's styrke som et modelsystem til at studere nervesystem funktion hovedsagelig stammer fra konvergensen af de magtfulde genetiske værktøjer til rådighed, og den brede vifte af robuste adfærdsmæssige analyser udvikles. Her præsenterer vi en enkel og bredt tilgængelig mikroskopi teknik til at erhverve digital video af Drosophila voksen og larvestadiet lokomotiv fænotyper af høj kvalitet fra en lateral perspektiv. Vi har med succes anvendt denne metode til at karakteris…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker at anerkende Alexandra Opie til teknisk bistand og støtte, James Barton for at levere video-fortælling, og Ramona Flatz og Joellen Sweeney til optræder i den medfølgende video. Dette arbejde blev støttet af MJ Murdock Charitable Trust (Grant nr 2012205 til JED).
Materials
| Trinocular Stereozoom Microscope | Olympus Corporation | SZ6145TR | ½ C-mount was removed and replaced with 1x C-mount |
| 1X C-mount | Leeds Precision Instruments | LSZ-1XCMT2 | |
| Digital Camera Coupler (43mm thread) | Qioptiq Imaging Solutions | 25-70-10-02 | |
| 58mm to 48mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR5848 | |
| 48mm to 43mm Step Down Ring | B&H Video | GBSDR4843 | |
| Lensmate Adapter Kit for Canon G10 | LensMateOnline.com | ||
| Canon PowerShot G10 Digital Camera | Canon U.S.A., Inc. | ||
| 1.5ml Spectroscopic PolystereneCuvette | Denville Scientific | U8650-4 |
Referências
- Zhang, B., Freeman, M. R., Waddell, S. . Drosophila neurobiology: a laboratory manual. , (2010).
- Frank, C. A., et al. New approaches for studying synaptic development, function, and plasticity using Drosophila as a model system. J Neurosci. 33, 17560-17568 (2013).
- Mudher, A., Newman, T. . Drosophila : a toolbox for the study of neurodegenerative disease. , (2008).
- Bilen, J., Bonini, N. M. Drosophila as a model for human neurodegenerative disease. Annu Rev Genet. 39, 153-171 (2005).
- Jakubowski, B. R., Longoria, R. A., Shubeita, G. T. A high throughput and sensitive method correlates neuronal disorder genotypes to Drosophila larvae crawling phenotypes. Fly (Austin). 6, 303-308 (2012).
- Caldwell, J. C., Miller, M. M., Wing, S., Soll, D. R., Eberl, D. F. Dynamic analysis of larval locomotion in Drosophila chordotonal organ mutants). Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 16053-16058 (2003).
- Jahn, T. R., et al. Detection of early locomotor abnormalities in a Drosophila model of Alzheimer’s disease. J Neurosci Methods. 197, 186-189 (2011).
- Donelson, N. C., et al. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. PLoS ONE. 7, e37250 (2012).
- Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotion in adult Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (24), (2009).
- Colomb, J., Reiter, L., Blaszkiewicz, J., Wessnitzer, J., Brembs, B. Open source tracking and analysis of adult Drosophila locomotion in Buridan’s paradigm with and without visual targets. PLoS ONE. 7, e42247 (2012).
- Demerec, M. . Biology of Drosophila. , (1965).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. J Insect Physiol. 46, 439-442 (2000).
- Greenspan, R. J. . Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics.. , (2004).
- Duncan, J. E., Lytle, N. K., Zuniga, A., Goldstein, L. S. The Microtubule Regulatory Protein Stathmin Is Required to Maintain the Integrity of Axonal Microtubules in Drosophila. 8, e683244 (2013).
- Belmont, L. D., Mitchison, T. J. Identification of a protein that interacts with tubulin dimers and increases the catastrophe rate of microtubules. Cell. 84, 623-631 (1996).
- Cassimeris, L. The oncoprotein 18/stathmin family of microtubule destabilizers. Curr Opin Cell Biol. 14, 18-24 (2002).
