وهناك طريقة لفحص والتحقق من الطفرات المقاومة ضد كيناز مثبطات
Summary
ظهور المقاومة الوراثية ضد العلاج كيناز المانع يشكل تحديا كبيرا لعلاج السرطان فعال. تحديد وتوصيف الطفرات المقاومة ضد المخدرات وضعت حديثا يساعد في تحسين إدارة السريرية وتصميم الأدوية الجيل القادم. هنا، نحن تصف بروتوكول لدينا في المختبر لفحص والتحقق من الطفرات المقاومة.
Abstract
أدى اكتشاف BCR / ABL باعتباره الجين الورمي السائق في سرطان الدم النخاعي المزمن (CML) في تطوير إيماتينب، والتي، في الواقع، أظهرت إمكانية استهداف كيناز في السرطانات عن طريق علاج فعال للمرضى CML. هذه الملاحظة ثورة في تطوير العقاقير لاستهداف تحركات أنكجنيك المتورطين في مختلف الأورام الخبيثة الأخرى، مثل EGFR، B-RAF، KIT وPDGFRs. ومع ذلك، عيب رئيسي واحد من العلاجات المضادة للكيناز هو ظهور الطفرات المقاومة للأدوية مما يجعل الهدف قد خفضت أو فقدت تقارب للدواء. فهم الآليات التي تستخدمها المتغيرات مقاومة لا يساعد فقط في تطوير مثبطات الجيل القادم ولكن أيضا يعطي دفعة لإدارة السريرية باستخدام الطب الشخصي. أبلغنا استراتيجية ناقلات فيروسات على أساس فحص لتحديد الطيف المقاومة منح الطفرات في BCR / ABL، الذي ساعد في تطوير الجيل القادم BCR / مثبطات ABL. باستخدام Ruxolitinib وJAK2 كزوج الهدف المخدرات، وهنا وصفنا في طرق الفحص في المختبر التي تستخدم خلايا الفأر BAF3 معربا عن مكتبة طفرة عشوائية من JAK2 كيناز.
Introduction
تحركات البروتينات هي الانزيمات التنظيمية الرئيسية داخل الخلايا مسارات نقل الإشارة التي تعدل على ما يبدو كل وظيفة الخلوية. والرقابة السليمة على كيناز بوساطة إشارات حاسمة إلى التوازن والتنمية، والتي تعتمد في الغالب على التنظيم السليم لتحركات، الفسفاتازات وتحلله من قبل شركة يو بي إس (نظام proteasome واليوبيكويتين). تحركات حررت هي في مركز الصدارة في العديد من أنواع السرطان وتورط في مجموعة من الأمراض التي تصيب الإنسان 1. الجينوم البشري بترميز أكثر من 500 تحركات البروتينات التي تم ربطها بشكل مباشر أو غير مباشر، إلى ~ 400 الأمراض التي تصيب الإنسان 2. دعمت هذه الملاحظات مفهوم لاستهداف العلاجي للتحركات التي كتبها مثبطات جزيء صغير 3-5.
قدمت مظاهرة من مثبطات كيناز ABL، مثل إيماتينب، في علاج سرطان الدم النخاعي المزمن (CML) الدليل على مفهوم لهذا النهج 6،7. هذه الملاحظة ثورة ليس فقط النملةط-كيناز العلاج ولكن أيضا فرض فكرة التعرف على الآفات الوراثية في أمراض الأورام الأخرى لاستهداف العلاجية، والتي تؤدي إلى اكتشاف الطفرات أنكجنيك في JAK2 من كثرة الحمر فيرا (PV) والمرضى الذين يعانون من الأورام التكاثر النقيي (MPN). هذا الاكتشاف ولدت اهتماما كبيرا في علاج MPNs من خلال استهداف JAK2 مع مثبطات كيناز جزيء صغير. الآن، ما يقرب من اثني عشر من مثبطات JAK2 هي في التجارب السريرية واحد منهم قد وافقت مؤخرا لعلاج تليف النقي. بينما استهداف معين من تحركات أنكجنيك بواسطة مثبطات جزيء صغير في سرطانات تجلب نتائج واعدة، أنها تعاني أيضا من تطوير مقاومة للعلاج. في الواقع، حتى الآن، والمرضى تعامل مع مثبطات كيناز، مثل إيماتينب، Gefitinib، Erlotinib وDasatinib وضعت الطفرات المقاومة في الغالب من خلال الحصول على الطفرات في المجال كيناز التي تستهدف المخدرات 8-10. المقاومة نتيجة لطفرة جينية تسلط الضوء على القيود سو استهدفت حيد ضد تحركات أنكجنيك، وتمثل التحدي المقبل في تطوير أكثر نجاحا من أي وقت مضى العلاج الكيميائي للسرطان. يجب أن عواقب الميكانيكية والوظيفية للمقاومة المخدرات توفر الأساس المنطقي لاختيار وتصميم مركبات مجانية لتطوير الأدوية. الطفرات التي تم تحديدها عبر الشاشات في المختبر، وقد أظهرت درجة عالية من الارتباط مع تلك التي وجدت في المرضى. لذلك، في المختبر لفحص الطفرات التي تمنح المخدرات المقاومة لإعطاء أزواج الهدف المخدرات في تمريرات التطوير السريري أو قبل السريرية في تحديد أنماط المقاومة التي من المحتمل أن تسبب الانتكاس السريري. تحديد هذه الأشكال متحولة ليست فقط مفيدة في مراقبة المرضى عن الاستجابة للدواء والانتكاس ولكنها ضرورية أيضا لتصميم أكثر قوة مثبطات الجيل القادم. على سبيل المثال، وتطوير الجيل القادم مثبطات BCR / ABL، Nilotinib وPonatinib، أدلى ممكن وذلك بسبب زيادة MECاكتسبت تفاهمات hanistic من الطفرات، والبنائية، والدراسات وظيفية.
في وقت سابق، ونحن قد أفادت نتائج الشاشة لدينا باستخدام الطفرات العشوائية من BCR / ABL للكشف عن الطيف من الطفرات التي تمنح مقاومة للمثبطات مثل إيماتينب 11،12، PD166326 12، وAP24163 13. النتائج ليس فقط تحديد الطفرات منح المقاومة والمرض السريري الانتكاس، ولكن قدمت أيضا فهم الآلية المقاومة للأدوية والمبادئ التي تحكم وظيفة كيناز 11،14. هنا نقدم التفاصيل المنهجي إضافي، وذلك باستخدام Ruxolitinib وJAK2 كزوج الهدف المخدرات، لتمكين تطبيق أوسع لهذه الاستراتيجية الفرز.
Protocol
Representative Results
Discussion
أثبتت نجاح السريري للإيماتينب في علاج CML ليس فقط إمكانية استهداف تحركات شفتين بواسطة مثبطات جزيء صغير، ولكن القيود كشفت أيضا العلاج المستهدفة: الانتكاس السريري وظهور الطفرات المقاومة للأدوية في الجينات المستهدفة. تحديد الطفرات المقاومة يساعد في تحسين إدارة السرير?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by grants to M.A. from NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) and the Leukemia Research Foundation. M.A. is a recipient of V-Scholar award from the V- Foundation. Authors are thankful to Dr. Sara Rohrabaugh for editing.
Materials
| name of Materials/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Cell and Tissue culture | |||
| BaF3 Cells | ATCC | ||
| HEK293T cells | ATCC | ||
| pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW | A gift from Ross Levine | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW | Made in house | ||
| pMSCV-V617F-Cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-Luciferase-puro.GW | Made in house | ||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
| Trapan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| INCB018424 (Ruxolitinib) | ChemieTeK | 941678-49-5 | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| Bacterial Culture | |||
| XL-1 red E.Coli cells | Agilent Tech | 200129 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock solution |
| Bacto agar | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood& tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| Expand long template PCR system | Roche | 1168134001 | |
| Wizard Sv gel and PCR clean up system | Promega | A9282 | |
| Pure Yield plasmid mini prep system | Promega | A1222 | |
| PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells | Invitrogen | 12535029 | |
| Gateway LR Clonase Enzyme mix | Invitrogen | 11791019 | |
| Mouse reagents | |||
| Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade | Promega | P1043 | |
| 1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting | |
Referências
- Huse, M., Kuriyan, J. The conformational plasticity of protein kinases. Cell. 109, 275-282 (2002).
- Melnikova, I., Golden, J. Targeting protein kinases. Nat Rev Drug Discov. 3, 993-994 (2004).
- Cohen, P. Protein kinases–the major drug targets of the twenty-first century. Nat Rev Drug Discov. 1, 309-315 (2002).
- Dancey, J., Sausville, E. A. Issues and progress with protein kinase inhibitors for cancer treatment. Nat Rev Drug Discov. 2, 296-313 (2003).
- Noble, M. E., Endicott, J. A., Johnson, L. N. Protein kinase inhibitors: insights into drug design from structure. Science. 303, 1800-1805 (2004).
- Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. N Engl J Med. 344, 1038-1042 (2001).
- Druker, B. J., et al. Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nat Med. 2, 561-566 (1996).
- Gorre, M. E., et al. Clinical resistance to STI-571 cancer therapy caused by BCR-ABL gene mutation or amplification. Science. 293, 876-880 (2001).
- Shah, N. P., et al. Multiple BCR-ABL kinase domain mutations confer polyclonal resistance to the tyrosine kinase inhibitor imatinib (STI571) in chronic phase and blast crisis chronic myeloid leukemia. Cancer Cell. 2, 117-125 (2002).
- Branford, S., et al. High frequency of point mutations clustered within the adenosine triphosphate-binding region of BCR/ABL in patients with chronic myeloid leukemia or Ph-positive acute lymphoblastic leukemia who develop imatinib (STI571) resistance. Blood. 99, 3472-3475 (2002).
- Azam, M., Latek, R. R., Daley, G. Q. Mechanisms of autoinhibition and STI-571/imatinib resistance revealed by mutagenesis of BCR-ABL. Cell. 112, 831-843 (2003).
- Azam, M., et al. Activity of dual SRC-ABL inhibitors highlights the role of BCR/ABL kinase dynamics in drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 9244-9249 (2006).
- Azam, M., et al. AP24163 inhibits the gatekeeper mutant of BCR-ABL and suppresses in vitro resistance. Chem Biol Drug Des. 75, 223-227 (2010).
- Azam, M., Seeliger, M. A., Gray, N. S., Kuriyan, J., Daley, G. Q. Activation of tyrosine kinases by mutation of the gatekeeper threonine. Nat Struct Mol Biol. 15, 1109-1118 (2008).
- Soverini, S., et al. Implications of BCR-ABL1 kinase domain-mediated resistance in chronic myeloid leukemia. Leukemia research. 38, 10-20 (2014).
- Deshpande, A., et al. Kinase domain mutations confer resistance to novel inhibitors targeting JAK2V617F in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 26, 708-715 (2012).
- Koppikar, P., et al. Heterodimeric JAK-STAT activation as a mechanism of persistence to JAK2 inhibitor therapy. Nature. 489, 155-159 (2012).
- Marit, M. R., et al. Random mutagenesis reveals residues of JAK2 critical in evading inhibition by a tyrosine kinase inhibitor. PLoS One. 7, 43437 (2012).
- Weigert, O., et al. Genetic resistance to JAK2 enzymatic inhibitors is overcome by HSP90 inhibition. The Journal of experimental medicine. 209, 259-273 (2012).
- Kesarwani, M., Huber, E., Azam, M. Overcoming AC220 resistance of FLT3-ITD by SAR302503. Blood cancer journal. 3, 138 (2013).
