キナーゼ阻害剤に対して耐性変異のスクリーニングおよび検証のための方法
Summary
キナーゼ阻害剤治療に対する遺伝的抵抗性の出現は、効果的な癌治療のための重要な課題を提起する。新たに開発された薬剤に対して耐性変異の同定および特徴は、より良い臨床管理、次世代薬剤設計に役立ちます。ここでは、in vitroスクリーニングおよび耐性変異の検証のために私たちのプロトコルを記述します。
Abstract
慢性骨髄性白血病（CML）におけるドライバ癌遺伝子としてBCR / ABLの発見は、実際には、効果的にCML患者の治療によって癌におけるキナーゼを標的とする可能性を示し、イマチニブの開発をもたらした。この観察は、EGFR、B-RAF、KIT及びPDGFRs、のような様々な他の悪性腫瘍に関与する発癌性キナーゼを標的とする薬剤の開発に革命をもたらした。しかしながら、抗キナーゼ療法の一つの主要な欠点は、薬物に対する親和性を減少または消失しているターゲットをレンダリングする薬剤耐性突然変異の出現である。耐性変異体で採用のメカニズムを理解することは、次世代の阻害剤の開発に役立つだけでなく、パーソナライズされた薬を使用する臨床管理に弾みを与えていないだけ。我々は、次の世代BCR / ABL阻害剤の開発に役立っているBCR / ABLの抵抗付与突然変異のスペクトルを識別するためのレトロウイルスベクターベースのスクリーニング戦略を報告した。 Ruxoliの使い方薬剤標的ペアとしてtinibとJAK2は、ここでは、JAK2キナーゼのランダム変異のライブラリーを発現するマウスBAF3細胞を利用vitroスクリーニング方法で説明します。
Introduction
プロテインキナーゼは、一見したところ、すべての細胞の機能を調節する細胞内シグナル伝達経路の重要な調節酵素である。キナーゼを介したシグナル伝達を適切に制御するには、主に、UPSによるキナーゼ、ホスファターゼ及びその分解の適切なレギュレーション（ユビキチンプロテアソーム系）に依存している恒常性と開発、非常に重要です。脱調節キナーゼは、多くの癌のセンターステージにあり、ヒト疾患1のホストに関与。ヒトゲノムは、〜400ヒト疾患2に、直接的または間接的にリンクされている500以上のタンパク質キナーゼをコードする。これらの観察は、小分子阻害剤3-5によるキナーゼの治療標的化のための概念を支 持した。
慢性骨髄性白血病（CML）の治療におけるこのようなイマチニブのようなABLキナーゼ阻害剤、の実証は、このアプローチ6,7のための概念の証拠を提供した。この観察だけでなく、アリに革命をもたらしI-キナーゼ療法だけでなく、骨髄増殖性新生物（MPN）で真性多血症（PV）と患者からJAK2における発癌性変異の発見につながる治療標的化のための他の腫瘍性疾患、遺伝的病変を識別するためのアイデアを施行。この発見は、小分子キナーゼ阻害剤とJAK2を標的とすることによりMPNsの治療に大きな関心を生成した。今、JAK2阻害剤のほとんどダースは、臨床試験中であり、そのうちの一つは、骨髄線維症の治療のために最近承認された。癌における小分子阻害剤による発癌性キナーゼの特異的ターゲティングは有望な結果をもたらすが、それはまた、治療に対する耐性を発現苦しむ。実際には、これまでのところ、そのようなイマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブおよびダサチニブのようなキナーゼ阻害剤で治療した患者は、大部分の薬物は、8-10をターゲットとするために、キナーゼドメインにおける変異を取得することにより、耐性変異を開発した。遺伝子突然変異の結果として抵抗がo制限を強調fは発癌性キナーゼに対する単剤療法を目標とし、これまで以上に成功した癌化学療法の開発の次の挑戦を表します。薬剤耐性の機構および機能的結果を選択し、薬剤開発のための無料の化合物の設計のための根拠を提供するべきである。 in vitroでの画面を使用して同定された変異は、患者に見られるものとの高度の相関を示している。したがって、臨床的再発を引き起こす可能性がある耐性パターンを識別するのに臨床的または前臨床開発を支援における所与の薬物標的のペアのための薬剤耐性を付与する変異をin vitroスクリーニング。これらの変異型を同定するだけでなく、薬物反応および再発について患者をモニタリングするのに役立つだけでなく、より強固な次世代阻害剤の設計のために必須である。たとえば、次の世代BCR / ABL阻害剤、ニロチニブとPonatinibの開発は、理由も大きいメックに可能作られたhanistic理解は、突然変異誘発、構造的、および機能的研究から得られた。
以前、我々はそのようなイマチニブ11,12、PD166326 12、及びAP24163 13と阻害剤に対する耐性を付与する変異のスペクトルを明らかにするために、BCR / ABLのランダム突然変異誘発を用いて私たちのスクリーニングの結果を報告している。結果は、臨床的な抵抗および疾患再発を付与する変異を同定し、だけでなく、薬剤耐性及びキナーゼ機能11,14を支配する原則のメカニズムの理解を提供するだけでなく。ここでは、このスクリーニング戦略のより広範な適用を可能にするために、薬物標的対としてRuxolitinibおよびJAK2を使用して、追加の方法論の詳細を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
臨床的再発と標的遺伝子中の薬剤耐性突然変異の出現：CMLの治療におけるイマチニブの臨床的成功は、小分子阻害剤による頬紅キナーゼを標的とする可能性が、標的療法のも明らかに限定するものではないだけを示した。耐性変異の同定は、より良い臨床管理及び次世代阻害剤の開発に役立つ。このプロトコルは、標的遺伝子に薬剤耐性変異を同定するための方法論を説明しています。この?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by grants to M.A. from NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) and the Leukemia Research Foundation. M.A. is a recipient of V-Scholar award from the V- Foundation. Authors are thankful to Dr. Sara Rohrabaugh for editing.
Materials
| name of Materials/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Cell and Tissue culture | |||
| BaF3 Cells | ATCC | ||
| HEK293T cells | ATCC | ||
| pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW | A gift from Ross Levine | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW | Made in house | ||
| pMSCV-V617F-Cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW | Made in house | ||
| pMSCV-Luciferase-puro.GW | Made in house | ||
| RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
| DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
| Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
| FBS | Atlanta biological | S11150 | |
| Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
| 1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
| L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | |
| Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
| Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
| Trapan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
| DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
| INCB018424 (Ruxolitinib) | ChemieTeK | 941678-49-5 | |
| WST-1 | Roche | 11644807001 | |
| 0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
| 70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
| Bacterial Culture | |||
| XL-1 red E.Coli cells | Agilent Tech | 200129 | |
| SOC | New England Biolabs | B90920s | |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock solution |
| Bacto agar | Difco | 214050 | |
| Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
| Kits | |||
| Dneasy Blood& tissue kit | Qiagen | 69506 | |
| Expand long template PCR system | Roche | 1168134001 | |
| Wizard Sv gel and PCR clean up system | Promega | A9282 | |
| Pure Yield plasmid mini prep system | Promega | A1222 | |
| PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells | Invitrogen | 12535029 | |
| Gateway LR Clonase Enzyme mix | Invitrogen | 11791019 | |
| Mouse reagents | |||
| Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade | Promega | P1043 | |
| 1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
| Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
| Instruments | |||
| NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
| Swing bucket rotor centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting | |
Referências
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