Opkomst van genetische resistentie tegen kinase remmer therapie vormt een serieuze uitdaging voor een effectieve behandeling van kanker. Identificatie en karakterisatie van resistente mutaties tegen een nieuw ontwikkelde geneesmiddel helpt bij een betere klinische behandeling en de volgende generatie geneesmiddelen. Hier beschrijven we ons protocol in vitro screening en validatie van resistente mutaties.
De ontdekking van BCR / ABL als bestuurder oncogen bij chronische myeloïde leukemie (CML) resulteerde in de ontwikkeling van Imatinib, die in feite aangetoond dat het potentieel van de kinase gericht op kanker door het effectief behandelen van de CML patiënten. Deze waarneming revolutie geneesmiddelenontwikkeling de oncogene kinasen betrokken bij diverse andere maligniteiten, zoals EGFR, B-RAF, KIT en PDGFRs richten. Echter, een belangrijk nadeel van anti-kinase therapieën is het ontstaan van resistentie mutaties waardoor de doelstelling om verminderde of verloren affiniteit voor het geneesmiddel. Inzicht in de mechanismen die in dienst zijn van resistente varianten niet alleen helpt bij het ontwikkelen van de volgende generatie-remmers, maar geeft ook een impuls aan klinische behandeling met behulp van gepersonaliseerde geneeskunde. We meldden een retrovirale vector screening strategie voor het spectrum van resistentie verstrekkend mutaties in BCR / ABL, die heeft bijgedragen in de volgende generatie BCR / ABL remmers te identificeren. Met behulp van Ruxolitinib en JAK2 als een drug target paar, hier beschrijven we in vitro screening methoden die de muis BAF3 cellen die de willekeurige mutatie bibliotheek van JAK2 kinase gebruikt.
Proteïne kinasen zijn belangrijke regulerende enzymen van intracellulaire signaaltransductie, die schijnbaar moduleren elke cellulaire functie. Een goede beheersing van kinase gemedieerde signalering is van cruciaal belang om de homeostase en ontwikkeling, die meestal berust op goede regulering van kinasen, fosfatasen en de afbraak ervan door UPS (ubiquitine proteasoom systeem). Gedereguleerd kinases zijn in het centrum stadium van vele vormen van kanker en betrokken bij tal van ziekten bij de mens 1. Menselijk genoom codeert voor meer dan 500 eiwitkinasen die zijn verbonden, direct of indirect, -400 menselijke ziekten 2. Deze waarnemingen worden ondersteund het concept voor therapeutische doelwitten van kinases door kleine molecule inhibitoren 3-5.
Het aantonen van ABL kinaseremmers, zoals Imatinib, in de behandeling van chronische myeloïde leukemie (CML) verstrekte de proof of concept van deze benadering 6,7. Deze observatie niet alleen een revolutie in de mieri-kinase behandeling ook afgedwongen het idee om de genetische laesies in andere neoplastische ziekten voor therapeutische doelwitten, die leiden tot de ontdekking van oncogene mutatie in het JAK2 van polycytemie vera (PV) en patiënten met myeloproliferatieve neoplasmen (MPN) identificeren. Deze ontdekking grote belangstelling bij de behandeling van MPNs door zich te richten JAK2 met kleine molecule kinase inhibitoren. Nu, een tiental van JAK2 remmers in klinische studies en een van hen is onlangs goedgekeurd voor de behandeling van myelofibrose. Hoewel specifieke targeting van oncogene kinasen door kleine molecule inhibitoren bij kanker brengen veelbelovende resultaten, lijdt ook van ontwikkeling van resistentie tegen de behandeling. In feite, tot nu toe, de patiënten behandeld met kinase-remmers, zoals imatinib, gefitinib, Erlotinib en Dasatinib ontwikkelde resistentie mutaties voornamelijk door de overname van mutaties in het kinase domein waartoe drug targets 8-10. Resistentie als gevolg van genmutatie benadrukt de beperkingen of gerichte monotherapie tegen oncogene kinasen, en is de volgende uitdaging in de ontwikkeling van steeds succesvolle chemotherapie. Mechanistische en functionele gevolgen van resistentie tegen geneesmiddelen moeten een achtergrond voor de keuze en het ontwerp van een gratis verbindingen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen te verstrekken. Mutaties die via in vitro schermen, blijkt een hoge mate van correlatie met die gevonden bij patiënten. Daarom, in vitro screenen op mutaties die resistentie voor een bepaald geneesmiddel doelparen in klinische of preklinische ontwikkeling helpt verlenen identificeren de resistentiepatronen die waarschijnlijk klinische terugval veroorzaken. De identificatie van deze mutante vormen is niet alleen nuttig bij de controle patiënten voor drug respons en terugval, maar eveneens essentieel voor het ontwerpen van robuustere volgende generatie remmers. Bijvoorbeeld, de ontwikkeling van de volgende generatie BCR / ABL remmers, nilotinib en Ponatinib, mogelijk gemaakt door een grotere mechanistic inzichten opgedaan met mutagenese, structurele en functionele studies.
Eerder hebben we de resultaten van onze scherm met willekeurige mutagenese van BCR / ABL het spectrum van mutaties die resistentie tegen remmers zoals imatinib 11,12, PD166326 12 en AP24163 13 onthullen gerapporteerd. De resultaten niet alleen gewezen op de mutaties die klinische resistentie en de ziekte van terugval, maar ook voorzien van de mechanistische begrip van resistentie tegen geneesmiddelen en beginselen voor de kinase functie 11,14. Hier bieden we aanvullende methodologische detail, met behulp van ruxolitinib en JAK2 als een drug target paar, om een bredere toepassing van deze screening strategie mogelijk te maken.
De klinische succes van Imatinib behandelen CML blijkt niet alleen het potentieel van de targeting rouge kinases kleine molecule inhibitoren, maar ook ontdekt beperkingen van gerichte therapie: klinische terugval en ontstaan van resistentie mutaties in het doelgen. Identificatie van resistentie mutaties helpt bij een betere klinische beheer en de ontwikkeling van de volgende generatie remmers. Dit protocol beschrijft een methode voor resistente mutaties in de beoogde gen te identificeren. Deze werkwijze gebruikt e…
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by grants to M.A. from NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) and the Leukemia Research Foundation. M.A. is a recipient of V-Scholar award from the V- Foundation. Authors are thankful to Dr. Sara Rohrabaugh for editing.
name of Materials/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
Cell and Tissue culture | |||
BaF3 Cells | ATCC | ||
HEK293T cells | ATCC | ||
pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW | A gift from Ross Levine | ||
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW | Made in house | ||
pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW | Made in house | ||
pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW | Made in house | ||
pMSCV-V617F-Cherry.GW | Made in house | ||
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW | Made in house | ||
pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW | Made in house | ||
pMSCV-Luciferase-puro.GW | Made in house | ||
RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
FBS | Atlanta biological | S11150 | |
Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | |
Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
Trapan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
INCB018424 (Ruxolitinib) | ChemieTeK | 941678-49-5 | |
WST-1 | Roche | 11644807001 | |
0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
Bacterial Culture | |||
XL-1 red E.Coli cells | Agilent Tech | 200129 | |
SOC | New England Biolabs | B90920s | |
Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock solution |
Bacto agar | Difco | 214050 | |
Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
Kits | |||
Dneasy Blood& tissue kit | Qiagen | 69506 | |
Expand long template PCR system | Roche | 1168134001 | |
Wizard Sv gel and PCR clean up system | Promega | A9282 | |
Pure Yield plasmid mini prep system | Promega | A1222 | |
PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells | Invitrogen | 12535029 | |
Gateway LR Clonase Enzyme mix | Invitrogen | 11791019 | |
Mouse reagents | |||
Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade | Promega | P1043 | |
1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
Instruments | |||
NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
Swing bucket rotor centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting |