Uppkomsten av genetisk resistens mot terapi kinashämmare innebär betydande utmaning för effektiv cancerbehandling. Identifiering och karakterisering av resistenta mutationer mot en nyutvecklad läkemedel hjälper till bättre klinisk behandling och nästa generations läkemedelsdesign. Här beskriver vi våra protokoll för in vitro screening och validering av resistenta mutationer.
Upptäckten av BCR / ABL som förare onkogen vid kronisk myeloisk leukemi (KML) resulterat i utvecklingen av Imatinib, vilket i själva verket visat potential inriktning på kinas i cancer genom att effektivt behandla CML-patienter. Denna observation revolutione läkemedelsutveckling att rikta de onkogena kinaser inblandade i flera andra maligniteter, såsom EGFR, B-RAF, KIT och PDGFRs. Men en stor nackdel med antikinas terapier uppkomsten av läkemedelsresistenta mutationer som gör målet att ha minskat eller förlorat affinitet för läkemedlet. Förstå mekanismer som resistenta varianter inte bara hjälper till att utveckla nästa generations hämmare men ger också impulser till klinisk hantering med hjälp personlig medicin. Vi rapporterade en retroviral vektor baserad screening strategi för att identifiera spektrumet av motstånd ger mutationer i BCR / ABL, vilket har bidragit till att utveckla nästa generations BCR / ABL hämmare. Använda Ruxolitinib och JAK2 som läkemedelsmål par, här beskriver vi i screening vitro-metoder som utnyttjar musen Baf3 cellerna uttrycker slumpmässig mutation bibliotek av JAK2 kinas.
Proteinkinaser är viktiga reglerande enzymer av intracellulära signaltransduktionsvägar som synes modulerar varje cellulär funktion. En ordentlig kontroll av kinas medierad signalering är avgörande för homeostas och utveckling, vilket till största delen bygger på korrekt reglering av kinaser, fosfataser och dess nedbrytning av UPS (ubiquitin proteasomsystemet). Avreglerade kinaser är i centrum för många cancerformer och inblandad i många mänskliga sjukdomar 1. Mänskliga genomet kodar mer än 500 proteinkinaser som har länkade direkt eller indirekt, till ~ 400 mänskliga sjukdomar 2. Dessa observationer stödde konceptet för terapeutisk inriktning av kinaser genom småmolekylinhibitorer 3-5.
Demonstrationen av ABL kinashämmare, såsom Imatinib, vid behandling av kronisk myeloisk leukemi (KML) förutsatt proof of concept för detta tillvägagångssätt 6,7. Denna observation inte bara revolution myrani-kinas behandling, men verk också idén att identifiera de genetiska skador i andra neoplastiska sjukdomar för terapeutisk inriktning, som leder till upptäckten av onkogena mutationer i JAK2 från polycytemia vera (PV) och patienter med myeloproliferativa tumörer (MPN). Denna upptäckt genererat stort intresse av att behandla MPNs genom att rikta JAK2 med små molekyler kinasinhibitorer. Nu, nästan ett dussin av JAK2-hämmare är i kliniska prövningar och en av dem har nyligen godkänt för behandling av myelofibros. Även särskild inriktning på onkogena kinaser genom småmolekylinhibitorer i cancer föra lovande resultat, lider också från att utveckla resistens mot behandlingen. I själva verket, så länge patienter behandlade med kinashämmare, såsom Imatinib, Gefitinib, Erlotinib och Dasatinib utvecklat resistens mutationer oftast genom att förvärva mutationer i kinas domän som läkemedelsmål 8-10. Motstånd som ett resultat av genmutation belyser begränsningarna of riktade monoterapi mot de onkogena kinaser, och representerar nästa utmaning i utvecklingen av allt mer framgångsrik kemoterapi. Mekanistiska och funktionella konsekvenser av läkemedelsresistens bör ge en grund för val och utformning av kostnads föreningar för läkemedelsutveckling. Mutationer identifierade genom in vitro-skärmar, har visat en hög grad av korrelation med de som finns hos patienter. Därför in vitro screening för mutationer som ger läkemedelsresistens för en viss läkemedels målparen i klinisk eller preklinisk utveckling hjälper till att identifiera de resistensmönster som kan orsaka kliniska återfall. Identifieringen av dessa muterade former är inte bara till hjälp för att övervaka patienter för läkemedelssvar och återfall men också viktigt för utformningen av mer robusta nästa generations hämmare. Till exempel utvecklingen av nästa generations BCR / ABL-hämmare, Nilotinib och Ponatinib, gjordes möjligt på grund av ökad mechanistic överenskommelser som vunnits från mutagenes, strukturella och funktionella studier.
Tidigare har vi rapporterat resultatet av vår skärm använder slumpmässig mutagenes av BCR / ABL att avslöja det spektrum av mutationer som ger resistens mot hämmare såsom Imatinib 11,12, PD166326 12, och AP24163 13. Resultaten inte bara identifierat de mutationer som ger klinisk resistens och återfall, men också den mekanistiska förståelsen av läkemedelsresistens och principer för kinasfunktionen 11,14. Här ger vi ytterligare metod detalj, med hjälp Ruxolitinib och JAK2 som läkemedelsmål par, för att möjliggöra en bredare tillämpning av denna screening strategi.
Den kliniska framgångar Imatinib vid behandling KML visade inte bara potentialen att rikta de rouge kinaser genom småmolekylinhibitorer, men också avslöjats begränsningar av målinriktad terapi: klinisk återfall och uppkomst av läkemedelsresistensmutationer i målgenen. Identifiering av resistensmutationer hjälper bättre klinisk förvaltning och utveckling av nästa generations hämmare. Detta protokoll beskriver en metod för att identifiera läkemedelsresistenta mutationer i riktade genen. Denna metod använd…
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by grants to M.A. from NCI (1RO1CA155091), NHLBI (1R21HL114074) and the Leukemia Research Foundation. M.A. is a recipient of V-Scholar award from the V- Foundation. Authors are thankful to Dr. Sara Rohrabaugh for editing.
name of Materials/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
Cell and Tissue culture | |||
BaF3 Cells | ATCC | ||
HEK293T cells | ATCC | ||
pMSCV-JAK2-V617F-puro.GW | A gift from Ross Levine | ||
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C.GW | Made in house | ||
pMSCV-JAK2-V617F/L983F.GW | Made in house | ||
pMSCV-JAK2-V617F/P58A.GW | Made in house | ||
pMSCV-V617F-Cherry.GW | Made in house | ||
pMSCV-JAK2-V617F/Y931C-cherry.GW | Made in house | ||
pMSCV-JAK2-V617F/L983F-cherry.GW | Made in house | ||
pMSCV-Luciferase-puro.GW | Made in house | ||
RPMI | Cellgro (corning) | 15-040-CV | |
DMEM | Cellgro (corning) | 15-013-CV | |
Penn/Strep | Cellgro (corning) | 30-002-CI | |
FBS | Atlanta biological | S11150 | |
Trypsin EDTA 1X | Cellgro (corning) | 25-052-CI | |
1XPBS | Cellgro (corning) | 21-040-CV | |
L-Glutamine | Cellgro (corning) | 25-005-CL | |
Puromycin | Gibco (life technologies) | A11138-03 | |
Protamine sulfate | Sigma | P3369 | 5mg/ml stock in water |
Trapan Blue solution (0.4%) | Sigma | T8154 | |
DMSO | Cellgro (corning) | 25-950-CQC | |
INCB018424 (Ruxolitinib) | ChemieTeK | 941678-49-5 | |
WST-1 | Roche | 11644807001 | |
0.45uM acro disc filter | PALL | 2016-10 | |
70um nylon cell stariner | Becton Dickinson | 352350 | |
Bacterial Culture | |||
XL-1 red E.Coli cells | Agilent Tech | 200129 | |
SOC | New England Biolabs | B90920s | |
Ampicillin | Sigma | A0166 | 100mg/ml stock solution |
Bacto agar | Difco | 214050 | |
Terrific broth | Becton Dickinson | 243820 | |
Agarose | Genemate | E-3119-500 | |
Kits | |||
Dneasy Blood& tissue kit | Qiagen | 69506 | |
Expand long template PCR system | Roche | 1168134001 | |
Wizard Sv gel and PCR clean up system | Promega | A9282 | |
Pure Yield plasmid mini prep system | Promega | A1222 | |
PCR Cloning System with Gateway Technology with pDONR 221 & OmniMAX 2 Competent Cells | Invitrogen | 12535029 | |
Gateway LR Clonase Enzyme mix | Invitrogen | 11791019 | |
Mouse reagents | |||
Vivo-Glo Luciferin in-vivo Grade | Promega | P1043 | |
1/2cc Lo-Dose u-100 insulin syringe 28 G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
Mortor pestle | Coor tek | 60316 and 60317 | |
Isoflorane (Isothesia TM) | Butler Schien | 29405 | |
Instruments | |||
NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator | Thermo scientific | ||
Swing bucket rotor centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
TC-10 automated cell counter | Bio-RAD | This is not necessary, one can use standard hemocytomemetr for cell counting |