Fra Fast Fluorescens Imaging til Molecular Diffusion Lov om Aktive cellemembraner i et kommersielt mikroskop

Summary

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Abstract

Det har blitt stadig tydeligere at den romlige fordeling og bevegelse av membran komponenter som lipider og proteiner er viktige faktorer i reguleringen av mange cellulære funksjoner. Imidlertid, på grunn av den raske dynamikk og de små strukturer som er involvert, blir en meget høy spatio-temporal oppløsning som kreves for å fange den virkelige opptreden av molekyler. Her presenterer vi den eksperimentelle protokollen for å studere dynamikken i fluorescently-merket plasma-membran proteiner og lipider i levende celler med høy spatiotemporal oppløsning. Spesielt, tillater denne metode trenger ikke å spore hvert molekyl, men den beregner populasjon adferd ved bruk av alle molekyler i et gitt område av membranen. Utgangspunktet er en rask avbildning av et gitt område på membranen. Etterpå blir en fullstendig spatio-temporal autokorrelasjonsfunksjonen beregnet korrelering ervervede bilder ved å øke tidsforsinkelser, for eksempel hver 2, 3, N repetisjoner. Det er mulig å vise at breddenfor toppen av de romlige autokorrelasjonen funksjons øker ved økende tidsforsinkelsen som en funksjon av partikkelbevegelser på grunn av diffusjon. Derfor passer av serien av autokorrelasjonsfunksjoner gjør det mulig å trekke ut den faktiske protein betyr kvadratisk forskyvning fra imaging (iMSD), her presentert i form av tilsynelatende diffusiviteten vs gjennomsnittlig forskyvning. Dette gir en kvantitativ visning av gjennomsnittlig dynamikken i enkle molekyler med nanometer nøyaktighet. Ved å bruke en GFP-merket variant av transferrin-reseptor (TfR), og en ATTO488 merket 1-palmitoyl-2-hydroksy-sn -glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) er det mulig å observere den tid og rom regulering av protein og lipid på diffusjon mikrometer-størrelse membran regioner i mikro-til-milli-sekunders tidsområde.

Introduction

Starter fra den opprinnelige "flytende mosaikk" modell av Singer og Nicolson, har bildet av mobilnettet plasma membran vært kontinuerlig oppdatert i løpet av de siste tiårene for å inkludere den nye rollen cytoskjelett og lipid-domener ^1,2.

De første observasjonene ble innhentet av fluorescerende gjenoppretting etter fotobleking (FRAP) avsløre at en betydelig andel av membran proteiner er immobile ^3-5. Disse banebrytende studier, men veldig lærerikt, led av den relativt dårlig oppløsning i verdensrommet (mikron) og (i sekunder) av FRAP oppsett. Også, å være et ensemble gjennomsnittsmåling, mangler FRAP i å gi informasjon om enkelt molekyl atferd.

I denne sammenheng er det mulig å spesifikt merke et enkelt molekyl med svært lyse koder (som tillater studiet av diffusjonsprosess ett molekyl av gangen) har vært meget vellykket. Spesielt, ved å skyvetidsoppløsning av Single Particle Tracking (SPT) tilnærming til mikrosekunder tidsskala, Kusumi, et al. fått tilgang til ukjente funksjoner i lipid og protein dynamikk som i stor grad bidratt til anerkjennelse av den rollen aktin-basert membran skjelett i membran fysiologi ^{6 7.} Disse funnene ble generert i så-kalt «plukket og gjerdet 'modellen, der lipid og protein diffusjon reguleres av aktin-baserte skjelett. Men, for å ha tilgang til den enorme mengden av informasjon gitt av SPT mange eksperimentelle saker må tas opp. Spesielt er merkningsmetode vanligvis består av mange trinn som produksjon, rensing og innføring av de merkede arter inn i systemet. Videre store etiketter, som quantum prikker eller metallnanopartikler, er ofte nødvendig for å nå den undermillisekund tidsskala, og tverrbindingen av målmolekylene av etiketten ikke kunne unngås i mange tilfeller. Til slutt, mange banerhar å bli tatt opp for å passe statistiske kriterier og samtidig en lav tetthet av etiketten er nødvendig for å tillate sporing.

Sammenlignet med SPT, fluorescens korrelasjonsspektroskopi (FCS), å overvinne mange av disse ulempene, utgjør en meget lovende tilnærming for å studere molekyldynamikk. Faktisk fungerer FCS vel også med dim og tette etiketter, slik at å studere dynamikken i fluorescerende protein-merket molekyler i forbigående transfekterte celler. Dessuten gjør det nå høye statistikken i en begrenset tidsperiode. Endelig er, til tross for "høy" densitet på etiketter FCS gir enkle molekyler informasjon. Takk til alle disse egenskapene, FCS representerer en veldig grei tilnærming og har blitt mye brukt til å studere lipid og protein dynamikk både i modellmembraner og i levende celler ^8-10. Mange forskjellige metoder er blitt foreslått for å øke evnen til FCS for å avdekke detaljer av molekylær diffusjon. For eksempel, det var shegne som ved å utføre FCS på forskjellig størrelse observasjon områder kan man definere en "FCS diffusjon lov" opplysende skjulte funksjoner i molekylær bevegelse ^11,12. Dessuten blir variert i størrelse, ble det sentrale område også duplisert ^13, beveges i rommet langs linjene ^14-20 eller konjugert med raske kameraer ^21,22. Ved hjelp av disse "spatio-temporal 'korrelasjon tilnærminger, ble relevante biologiske parametere av flere membran komponenter kvantitativt beskrevet på både modellmembraner og faktiske biologiske seg, noe som gir innsikt i membran romlige organiseringen.

Men i alle de FRAP FCS og anvendelser som er beskrevet så langt størrelsen på det sentrale området utgjør en begrensning i romlig oppløsning som ikke kan overvinnes. Flere super-Resolution Imaging metoder har nylig blitt utviklet for å omgå denne begrensningen. Noen er basert på lokalisering presisjon, for eksempel stokastisk optisk gjenoppbygging mikroskopi (STORM) <sup> 23,24, fotoaktivering lokalisering mikroskopi (PALM) ^25, fluorescens PALM (FPALM) ^26, og enkeltpartikkelsporings PALM (sptPALM) ^27: den relativt store mengden av fotoner som kreves ved hvert stillbilde, men begrenser tiden oppløsningen disse metodene til minst flere millisekunder, og dermed hindre deres anvendelse i vivo.

I kontrast, har et lovende alternativ for oppløsning super blitt åpnet av romlig moduler fluorescensemisjonen med stimulert emisjon uttømming metoder (STED eller reversible metningsbar optiske fluorescens overganger (RESOLFT)) ^28,29. Disse tilnærmingene kombinere utformingen av observasjons volum godt under diffraksjon grensen med muligheten til å bruke rask skanning mikroskoper og deteksjonssystemer. I kombinasjon med fluorescens svingninger analyse, STED mikros lov til å direkte sondere nanoskala tid og rom dynamikken i lipider og proteins i levende cellemembraner ^30,31.

De samme fysiske mengder STED-baserte mikroskopi kan oppnås ved en modifisert spatio-temporal bildekorrelasjonsspektroskopi (pinner ^32,33) metode som er egnet for undersøkelsen av dynamikken i fluorescensmerket-merkede membranproteiner og / eller lipider i levende celler og ved en kommersielt mikroskop. Den eksperimentelle protokollen som presenteres her er komponert av noen få trinn. Den første krever en rask avbildning av regionen av interesse på membranen. Deretter blir den resulterende stabel av bilder som brukes for å beregne den gjennomsnittlige romlige-tidsmessige korrelasjonsfunksjoner. Ved montering av serien av korrelasjonsfunksjoner, kan den molekylære 'diffusjon lov »fås direkte fra avbildning i form av en tilsynelatende diffusivitet (D _app) – vs -average forskyvning plot. Denne tomten kritisk avhengig av miljøet utforsket av molekylene og lar erkjenner direkte selve diffusjon moduserav lipid / protein av interesse.

I flere detaljer, som tidligere er vist ^34, den spatio-temporal autokorrelasjonsfunksjonen til ervervet bildeserien kritisk avhengig av dynamikken i molekylene beveger seg i samlet bildeserien (bemerk at den samme resonnement kan anvendes i en linje anskaffelse der bare én dimensjon i verdensrommet er vurdert). Spesielt definerer vi korrelasjonsfunksjon som:

(1)

hvor representerer den målte fluorescensintensiteten i posisjon x, y, og ved tidspunktet t, og representerer avstanden i x ogy-retningene henholdsvis representerer tidsforsinkelsen, og representerer gjennomsnittet. Denne funksjon kan uttrykkes som:

(2)

hvor n representerer det gjennomsnittlige antall molekyler i observasjonsområdet, representerer konvolusjon drift i rommet, og representerer autokorrelasjon av instrumental midjen. Dette siste kan tolkes som et mål på hvordan fotoner av en enkelt emitter er spredt ut i rommet på grunn av den optiske / opptaksoppsettet (den såkalte punktspredefunksjon, PSF, genetrally godt rundet av en Gaussisk funksjon). Endelig representerer sannsynligheten for å finne en partikkel i en avstand og etter en tidsforsinkelse . Hvis vi vurdere et diffusiv dynamikk, der partiklene beveger seg tilfeldig i alle retninger og netto fluks ikke er til stede, er denne funksjonen også godt rundet av en Gaussisk funksjon der variansen kan identifiseres som Mean Square Vekt (MSD) av bevegelige partikkel . Således midje av korrelasjonsfunksjon (også omtalt som ), Kan defineres som summen av de partikkel MSP og den instrument midje og kan måles ved en gaussisk formlingen av korrelasjonsfunksjonen for hvert tidsforsinkelse. Den måles i MSD kan brukes til å beregne en tilsynelatende diffusivitet for de bevegelige molekyler og en gjennomsnittlig forskyvning som:

(3)

(4)

Noen betraktninger om den eksperimentelle oppsettet brukt kan veilede leseren gjennom de følgende avsnittene. For selektivt å eksitere fluoroforer i basalmembranen av levende celler vil vi bruke en total intern refleksjon (TIR) ​​belysning, ved hjelp av en kommersiell TIR fluorescens (TIRF) mikroskop (detaljer kan finnes i materialet avsnitt). Videre, for å samle the fluorescens vil vi bruke en høy forstørrelse objektiv (100X NA 1,47, er høy numerisk apertur som kreves for TIRF belysning) og en EMCCD kamera (fysiske størrelsen på pixel på brikken 16 mikrometer). For å nå en pikselstørrelse på 100 nm vi bruke en ekstra forstørrelse linsen på 1.6x. Som omtalt nedenfor, vil en tidsoppløsning under 1 ms være nødvendig å beskrive riktig dynamikken i membranlipider raske under 100 nm. For å nå dette tidsoppløsning må vi velge et område av interesse (ROI) mindre enn hele chip av kameraet (512 x 512). På denne måten, vil kameraet lese et redusert antall linjer øker tidsoppløsning. Men i denne avlesning regime rammen tid ville være begrenset av tiden det tar å skifte summen fra eksponering for avlesning chip på kameraet og er vanligvis i størrelsesorden millisekunder for 512 x 512 pixel EMCCD. Å slå denne grensen, kan en ny teknologi skiftende ROI-linjer bare i stedet for hele rammen, wed en praktisk effektiv reduksjon av chip størrelse eksponert (kalt Cropped Sensor Mode i vår EMCCD). For denne konfigurasjon for å være effektiv, må chip utsiden av ROI dekkes med et par slisser som er montert i den optiske banen. Takket være denne sette opp en tidsoppløsning ned til 10 ^-4 sekunder kan oppnås. Vær imidlertid oppmerksom på at denne tilnærmingen kan være kombinert med mange ulike forsøksoppsett, som forklart i 'diskusjon' del.

Demonstrasjon av fremgangsmåten vil bli gitt i levende celler, ved å bruke både en ATTO488 merket 1-palmitoyl-2-hydroksy-sn -glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-PPE) og et GFP-merket variant av transferrinreseptoren (GFP- TfR). I tilfelle av ATTO488-PPE denne tilnærmingen kan med hell gjenvinne en nesten konstant D _app som en funksjon av gjennomsnittlig forskyvning indikerer en hovedsakelig fri diffusjon, som tidligere rapportert ^30,35. Derimot, viser TfR-GFP en avtagende D <sub> app som en funksjon av gjennomsnittlig forskyvning, noe som tyder delvis begrenset diffusjon ^6. Videre, i det sistnevnte tilfelle er det mulig å kvantifisere den lokale diffusjonskonstant og gjennomsnittlig innesperring området over mange mikron på membranplanet.

Protocol

1. systemkalibrering Punktspredefunksjon (PSF) kalibrering Fortynn 10 mL av 30 nm fluorescerende bead-løsning (omtrent 5 mM) i 90 mL av destillert vann og deretter sonicate løsningen i 20 min. Skjær en firkant (1 cm x 1 cm) stykke agarosegel (3%) og innskudd 10 ul av oppløsningen på toppen av gelen. Velte stykke gelen i bunnen av glass en 2 cm petriskål og klem fallet på glasset. Slå på kjøpet oppsett, sette prøven i holderen, sett kameraet eksponering og EMgain (100 msek og 1000…

Representative Results

For å kalibrere den instrument midjen, kan bildet av en enkelt fluorescerende nano-vulsten være tiltak som beskrevet i protokoll trinn 1.1. En typisk fluoriserende bilde av disse perlene er presentert i figur 1. Festingen av intensitetsfordelingen av en 2D gaussisk funksjon gir tilbake gode restprodukter, og gjør det mulig å måle den instrument midjen på 270 nm. Denne verdien er i god overensstemmelse med den forventede diffraksjon grensen anslått av Rayleigh ligningen. Denne kalibrering ikke er …

Discussion

Enkelt partikkel tracking (SPT) representerer en av de mest vanlige strategier for å studere molekyldynamikk, og det har den store fordelen av å måle partikkelbaner. Dette i sin tur gjør det mulig for sondering oppførselen selv noen merkede partikler i et komplekst system. Imidlertid, for å oppnå denne fordel SPT må vanligvis en lav tetthet av sonden og meget lyse etiketter. Spesielt, for å oppnå høy tidsoppløsning (usekunder range) uorganisk probe er vanligvis nødvendig (f.eks kvanteprikker eller …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
iXon Ultra 897	Andor	DU-897U-CS0
Solis	Andor
CHO-K1	ATCC	CCL-61
ATTO 488 labeled PPE	ATTO-TEC GmbH	AD 488-151
DOPE	Avanti Polar Lipids, Inc.	850725
DOTAP	Avanti Polar Lipids, Inc.	890890
100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine	Gibco	10378-016
DMEM/F-12	Gibco	21331
FBS	Gibco	10082147
HEPES	Gibco	15630-106
PBS	Gibco	10010-023
SimFCS 3.0	Globals Software		the software can be downloaded here: http://www.lfd.uci.edu/globals/
DMI6000 with TIRF modulus	Leica
LAS AF	Leica
Lipofectamine 2000	Lipofectamine	11668019
Matlab	MathWork
Imagej	NIH
C-terminal GFP tagged Tranferrin Receptor	OriGene	RG200980
Agar	Sigma Aldrich	A5306
Chloroform	Sigma Aldrich	528730
Latex beads, fluorescent yellow-green, 30 nm	Sigma Aldrich	L5155
SONICA Ultrasonic Cleaners	SOLTEC	ETH S3
Petri Dishes	Willco	GWSt-3522
Bio-Format importer for Matlab			http://www.openmicroscopy.org/site/support/bio-formats5/users/matlab/
ICS-MatLab Tools			https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip
Simulation by Matlab Tutorial			https://www.cellmigration.org/resource/imaging/icsmatlab/ICSTutorial.html
Simulation by SimFCS Tutorial			https://www.cellmigration.org/resource/imaging/ppt-pdf/RICS%20Simulations.ppt