셀 기반의 ELISA 분석을 사용하여 HIV-1 삼량 봉투 당 단백질의 구조적 평가
Summary
Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.
Abstract
HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.
Introduction
삼량 바이러스 엔벨로프 당 단백질 (봉투)에 의해 매개되는 인간 면역 결핍 바이러스 1 형 (HIV-1) 항목은 전염성주기의 첫 번째 단계입니다. 비리의 표면에서 발표 만 노출 바이러스 항원이기 때문에, 봉투 삼량은 중화 및 nonneutralizing 항체를 이끌어 낸다. 따라서, 그것은 백신의 면역원 디자인에 대한 흥미있는 후보를 나타냅니다. 그러나, 수용성 또는 재조합 형태로 봉투와 함께 예방 접종 시험 차 HIV-1가 1-3 분리 대부분에 대한 최소한의 효과와 반응을 이끌어 냈다. 그럼에도 불구하고, 부분적인 효능 면역원 후보로 HIV-1 봉투의 RV144 백신 재판 4 새로운 관심에서 관찰. 이는 백신 유도 항 봉투 항체는 SIV에 대한 보호의 어느 정도를 생성하기에 충분했고, HIV 5 도전 것을 나타내는 최근 연구에 의해 확증되었다.
소포체에서 합성되고, 봉투의 glycoprote 후전구체, gp160에, 바이러스 성 융합 프로세스 연료하는 능력에 중요한 다양한 번역 후 변형을 겪는다. 봉투 전구체는 gp120의-gp41의 연락을 유지 비공유 상호 작용으로, 그 여분의 세포질 gp120의 및 횡단 gp41 서브 유닛 6-10로 분해되기 전에 삼량에 적절하고 동료 접어해야합니다. 감염된 세포는 주로 기계의 전체 질량 (11, 12)의 50 % 정도를 포함하는, 봉투 glycosylating을 담당한다. 더 나은 다른 입체 형태를 이해하는 중요성을 강조 봉투는 적응하고, 그렇지 않으면 15 ~ 19 노출 될 수있는 특정 높은 면역 원성 항원을 숨길 수 있도록 생각하는 준 안정성을 제공하면서 그 결과 복잡한 구조는, 봉투는 13, 14 구조적으로 유연하게 할 수 있습니다 기본 봉투 삼량 체에 의해 샘플링.
지금까지 여러 가지 기술들이 개발되고 성공적 봉투 구조적 CH를 연구하는데 사용되어왔다Anges의. 그러나, 그들은 종종 특정 봉투 컨텍스트로 제한되고, 자신의 한계에 따라 다릅니다. 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명 형태 또는 특정 모노클로 날 항체를 사용하여 면역 침전 분석법 (모노클로 날 항체)은, 하나는 자신의 삼량 체 형태 20,21 immunogenetically에서 상이한 것으로 알려진 모노머 용해 또는 가용화 된 봉투 분자에 의존한다. 최근의 연구는 분열은 주로 항체 14,22,23를 nonneutralizing 인식 항원의 노출이 봉투의 입체 형태에 영향을 미치는 것이 좋습니다.
여기에서 우리는 세부 사항에서 cellularly 발현 봉투의 삼량 18,24-26의 형태를 빠르고 쉽게 결정을 허용하는 방법을 설명합니다. 인간 점착성 세포주에서 봉투의 일시적인 형질 감염에 이어 봉투 특정 항체의 결합은 단순한 화학 발광 반응을 이용하여 검출된다. 이 기술은 또한 환경의 구조적 특성을 사용할 수있는 형태를-의존적이다덴트 항체. 따라서, 이러한 분석은 강력하고 매우 유연한 검출 방법을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 분석은 HIV-1 삼량 봉투는 세포 표면에 발현하여 특정 모노클로 날 항체의 상호 작용을 검출하기 위해 최적화된다. 프로토콜이 확립 한 후에는 전체적으로 낮은 재료 비용 및 항체의 적은 양의 높은 처리량으로 매체에서 사용될 수있다. 이 분석은 형질 기반이기 때문에, 용이하게 봉투의 형태에 미치는 영향을 연구하기 위해 같은 CD4와 같은 세포 단백질의 동시 발현을 위해 적응 될 수있다.
<p…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그의 관대 한 A32, 17B, 48D의 선물 및 C11 모노클로 날 항체 박사 제임스 로빈슨 감사합니다. PGT (121)는 NIH AIDS 시약 프로그램, AIDS, NIAID, NIH (고양이 # 12343) 부문을 통해 얻었다. 이 작품은 과학자 AF와 CRCHUM 연속체 보조금에 의해뿐만 아니라 CIHR 촉매 부여 # 126630로 # 24639을 부여 영 FRQS 설립하여, CIHR 운영 # 257792로, 혁신 프로그램 리더 # 29866에 대한 캐나다 재단에 의해 지원되었다 AF 및 MR합니다. AF는 FRSQ Chercheur Boursier 주니어 1 교제 번호에 24639를받는 사람이다. MV는 CIHR 박사 연구 상 번호 291485에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
| White Opaque Tissue Culture Plate, 96 well, Flat Bottom | BD | 353296 | |
| Polyethylenimine, linear, 25000 MW | Polysciences | 23966 | Prepared in 1mg/ml solution |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11995 | |
| Goat Anti-Human IgG, Peroxidase Conjugated | Pierce | 31413 | |
| Enhanced Chemiluminescence Substrate | PerkinElmer | NEL105001EA | |
| TriStar LB 941, Plate Reader | Berthold Technologies |
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