Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.
HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.
Humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1) posten, förmedlad av de trimera virala höljesglykoproteiner (Miljö) är det första steget i infektionscykeln. Att vara den enda exponerade virala antigen som presenteras på ytan av virioner, Env trimer framkallar neutraliserande och icke-neutraliserande antikroppar. Som sådan utgör den en intressant kandidat för vaccinimmunogen design. Men vaccinationsförsök med Env i lösliga eller rekombinanta former framkallade svar med endast minimal effekt mot de flesta primära HIV-1-isolat 1-3. Ändå partiell effekt observeras i RV144 vaccin prov 4 förnyat intresse för HIV-1 Env som ett immunogen kandidat. Detta bekräftades av en färsk studie som beskriver att vaccin framkallade anti-Env antikroppar var tillräcklig för att generera ett visst skydd mot SIV och HIV utmanar 5.
Efter att syntetiseras i det endoplasmatiska retiklet, Env glycoprotei föregångaren, gp160, genomgår olika posttranslationella modifieringar som är kritiska för dess förmåga att underblåsa den virala fusionsprocessen. Den Env gångare måste lägga sig på rätt sätt och umgås i trimerer innan de klyvs i sina extra cytoplasmatiska gp120 och gp41 trans subenheter 6-10, med icke-kovalenta interaktioner upprätthålla förbindelse gp120-gp41. Den infekterade cellen maskiner är också ansvarig för tungt glykosylering Env, omfattar ca 50% av dess totala massa 11,12. Den resulterande komplexa struktur gör Env vara konforma flexibel 13,14, samtidigt som en metastabilitet som är tänkt att låta Env att anpassa och dölja vissa mycket immunogena epitoper som annars skulle utsättas 15-19, belyser vikten av att bättre förstå de olika konformationer samplas av den infödda Env trimer.
Hittills har flera tekniker utvecklats och med framgång använts för att studera Env konformationell lmAnges. Men de varierar i sina begränsningar, som ofta begränsas till specifika Env sammanhang. Exempelvis ytplasmonresonans eller immunfällningsanalyser med användning konforma specifika monoklonala antikroppar (mAbs), förlitar sig på antingen monomera lösliga eller solubiliserade Env-molekyler som är kända för att vara immunogenetically annorlunda än sina trimera former 20,21. Färska studier tyder också på att klyvning påverkar Env konformationer som leder till exponering av epitoper som främst uppkommit genom icke-neutraliserande antikroppar 14,22,23.
Här beskriver vi i detalj en metod som möjliggör snabb och enkel bestämning av konforma av cellulärt uttryckt Env trimerer 18,24-26. Efter övergående transfektion av Env i en human vidhäftande cellinje bindningen av Env-specifika antikroppar detekteras med hjälp av en enkel kemiluminiscens reaktion. Denna teknik kan också användas för att karakterisera den konforma preferens av konforma-DEPENdent antikroppar. Således tillhandahåller denna analys en robust och mycket flexibel detektionsmetod.
Denna analys är optimerad att detektera interaktion av specifika mAbs med HIV-1 trimera Env uttrycktes vid cellytan. När protokollet har fastställts, kan den användas vid medelhöga till höga genomflöden med låga totalkostnader material och små mängder av antikroppar. Eftersom denna analys är transfektion baserad, kan den lätt anpassas för samuttryck av cellulära proteiner såsom CD4 för att studera deras effekter på Env konformation.
Men transfektion basen av detta protokoll …
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr James Robinson för hans generösa gåva av A32, 17b, 48d, och C11 mAbs. PGT 121 erhölls genom NIH aids Reagens Program, Avdelningen för aids, NIAID, NIH (katalognummer 12343). Detta arbete stöddes av en Canada Foundation for Innovation Program Leader # 29866, med en CIHR drifts # 257.792, med ett FRQS Etablering av Young Scientist bevilja # 24639 till AF och en CRCHUM kontinuum bidrag samt av en CIHR katalysatorbidrags # 126.630 till AF och MR. AF är mottagare av ett FRSQ Chercheur Boursier Junior 1 gemenskap # 24639. MV stöddes av en CIHR Doctoral Research Award # 291.485.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
HOS cells | ATCC | CRL-1543 | |
White Opaque Tissue Culture Plate, 96 well, Flat Bottom | BD | 353296 | |
Polyethylenimine, linear, 25000 MW | Polysciences | 23966 | Prepared in 1mg/ml solution |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11995 | |
Goat Anti-Human IgG, Peroxidase Conjugated | Pierce | 31413 | |
Enhanced Chemiluminescence Substrate | PerkinElmer | NEL105001EA | |
TriStar LB 941, Plate Reader | Berthold Technologies |