체외 메틸화 분석에서 단백질 아르기닌 메틸화를 공부합니다
Summary
단백질 아르기닌 메틸화, 즉 효소의 클래스에 의해 촉매. 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼 (PRMTs)는 단백질 내의 아르기닌에 메틸기 (들)의 첨가의 효소 과정이다. 체외 메틸화 분석은 공지 또는 신규 PRMT 기판의 메틸화 상태를 평가하기위한 가장 신뢰할 도구이다.
Abstract
단백질 아르기닌 메틸화는 핵에서 가장 풍부하게 번역 후 변형 중 하나이다. 단백질 아르기닌 메틸화는 식별 및 / 또는 프로테오믹스 방법을 통해 결정, 및 / 또는 메틸 아르기닌 특이 항체 발현 수준으로 할 수있다. 그러나, 이러한 기술은 때때로 오해의 소지가 될 수 있으며 종종 거짓 긍정적 인 결과를 제공한다. 가장 중요한 것은, 이들 기술은 메틸화 분석법은, 반면에, 민감한 유용한 생화학 분석법이다 체외. PRMT의 기질 특이성을 지원하는 직접적인 증거를 제공 할 수 있고, 식별 된 단백질이 실제로 PRMT 기판 인 경우 일관 공개. 전형적인 관내 메틸화 분석은 정제 된 활성 PRMTs 정제 기판과 방사성 동위 원소 표지 된 메틸 공여체 (S-아데노 실-L-[메틸 3 H] 메티오닌)을 포함한다. 여기에서 우리는 촉매 활성 PRMT1, 재하 표현 PRMT의 가족을 분리하는 단계별 프로토콜을 설명합니다. 나정제 PRMT1의로 메틸 트랜스퍼 활동 이후 S-아데노 실-L-메틸 공여체로서 [메틸 3 H] 메티오닌의 존재하에, 단백질 1 (G3BP1)를 결합 라스-GTPase 활성화 단백질, 공지 PRMT 기판 상에 시험 하였다. 이 프로토콜은 새로운 생리 PRMT1 기판의 메틸화 상태를 설정하기위한,뿐만 아니라 단백질 아르기닌 메틸화의 기본 메커니즘을 이해하기 위해 단지 사용될 수있다.
Introduction
단백질의 메틸화는 첫째 1968 일에 설명했다. 그것은 연구자들이이이 번역 후 변형의 중요성을 인식하기 시작, 1996 년 PRMT1의 첫 번째 복제까지되지 않았습니다. 흥미롭게도, 핵 추출물의 단백질 아르기닌 잔기의 약 2 %는이 수정의 풍요 로움을 나타내는 3 메틸화된다. 아르기닌 될 수 아르기닌 측쇄 내의 염기성 측쇄와 질소 / s와 양전하를 띤 아미노산 포스트 병진 메틸기, 아르기닌 메틸화 4-6로 알려진 프로세스를 추가로 변경됨. 아르기닌 메틸화 효소 즉의 클래스에 의해 촉매된다. 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼 (PRMTs). 아르기닌은 monomethylated 또는 dimethylated 후자는 공정 4-6 PRMTs 촉매의 종류에 따라 대칭 또는 비대칭이 될 수 될 수 있습니다.
arginin 표시 단백질전자 글리신이 풍부한 모티브 PRMT 매개 촉매에 대한 잠재적 인 대상이다. 기판 PRMT 매개 메틸화 정상 세포 항상성 7-9에 중요한 모두의 단백질 – 단백질 상호 작용, 단백질 – 핵산 상호 작용, 단백질 기능, 유전자 발현 및 / 또는 세포 신호 전달을 조절하는 것으로 나타났다. 단백질 아르기닌 메틸화의 생물학적 역할을 이해하기 위해서는, 정확한 효율과 재현성이 분석법은 식별 PRMT 기판의 메틸화 상태를 설정하기 위해 필요하다.
자신의 기판의 메틸화를 촉진하기 위해 정제 PRMTs의 능력을 평가하는 시험 관내 메틸화 분석에서, 아르기닌 메틸화 10-12 연구를위한 잘 받아 분석이다. 이 분석의 전반적인 성공은 대부분 정제 된 PRMTs의 활동에 따라 달라집니다. PRMTs 표현 박테리아 나 포유류 세포 10,11로부터 정제 할 수있다. D 등이 체외 메틸화 분석,프로토콜 절에 etailed 원래 티니와 동료 (10)에 의해 설명 된 방법에 기초한다. 이 프로토콜에서는 상세히 PRMT1 포유류 세포에서의 발현 및 정제하는 단계를 나타낸다. 단백질 결합 단백질 1 (G3BP1), 공지 PRMT 기판 (8)를 활성화하는 라스-GTPase에 메틸화를 촉진하는 정제 PRMT1의 능력은 이상과 같은 S-아데노 실-L-[메틸 3 H] 메티오닌의 존재하에 평가 하였다 메틸 공여체. 이 분석을 사용하여, 우리는 확실하게 단백질 아르기닌 메틸화 연구에서 주요 단계 메틸 레이트 신규 또는 공지 된 기판에 PRMTs의 능력을 정의 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본원에 기재된 프로토콜은 통상적으로 식별 PRMT 기판의 메틸화 상태를 설정하는 데 사용된다. 이 강력하고 일관성있는 분석은 또한 기판에 대한 PRMTs의 특이성에 대한 결정적인 증거를 제공 할 것입니다. 이 분석의 성공을위한 핵심 구성 요소는 다음과 같습니다 포유 동물 세포에서 PRMTs의 1 식, 정제 PRMTs의 2 활동, 3 식 및 기판의 정제 및 니트로 셀룰로오스 막에 단백질의 4 완료 서부 전송.
<p cl…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
본 연구는 재향 군인의 미국학과에서 우수상 지원하고, NIH는 RW하는 R01CA138528을 부여했다.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine | Perkin Elmer | ||
| Ecoscint ultra | National Diagnostics | LS-270 | |
| Bottle top dispenser | National Diagnostics | LS-900 | |
| AutoFluor | National Diagnostics | LS-315 | |
| 6 ml Scintillation Vials | National Diagnostics | SKU:SVC-06 | |
| GST-sepharose | GE Life Sciences | ||
| L-Glutathione Reduced | Sigma | G4251 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | Transfection reagent | |
| Beas2B | ATCC | ||
| Optimem | Invitrogen | ||
| NP-40 | US-Biologicals | ||
| SDS | Sigma | ||
| Sodium deoxycholate | Sigma | ||
| PMSF | Sigma | ||
| anti-HA affinity matrix | Roche | ||
| Tris | Sigma | ||
| Nacl | Sigma | ||
| Bio-rad gel doc | Bio Rad | ||
| anti-HA antibody | roche | ||
| Ponseau S | Fisher Scientific |
Referências
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