في المختبر مثلأيشن الفحص لدراسة البروتين أرجينين مثلأيشن
Summary
بروتين أرجينين مثيلة، يحفزه فئة من الإنزيمات وهي، البروتين الميثيل أرجينين transferases (PRMTs)، هو عملية إضافة الأنزيمية من مجموعة الميثيل (ق) إلى arginines داخل البروتينات. في المختبر فحص الحامض هو الأداة الأكثر الاعتماد عليها لتقييم حالة مثيلة من ركائز PRMT معروفة أو جديدة.
Abstract
بروتين أرجينين مثيلة هي واحدة من التعديلات بعد متعدية الأكثر وفرة في النواة. يمكن تحديد البروتين أرجينين مثيلة و / أو عبر تحديد النهج البروتين و / أو immunoblotting مع الأجسام المضادة المحددة ميثيل أرجينين. ومع ذلك، هذه التقنيات يمكن أن تكون أحيانا مضللة وغالبا ما تقدم نتائج إيجابية كاذبة. الأهم من ذلك، يمكن لهذه التقنيات لا توفر دليلا مباشرا في دعم خصوصية PRMT الركيزة. في المختبر فحوصات الحامض، من ناحية أخرى، هي فحوصات الكيمياء الحيوية المفيدة، التي تعتبر حساسة، وتكشف باستمرار إذا كانت البروتينات التي تم تحديدها هي في الواقع ركائز PRMT. يتضمن نموذجية في المختبر فحص الحامض المنقى، PRMTs النشطة، الركيزة المنقى والنظائر المشعة وصفت المانحة الميثيل (S-أدينوزيل-L- [ميثيل 3 H] ميثيونين). نحن هنا وصف بروتوكول خطوة بخطوة لعزل PRMT1 نشطة حفاز، أحد أفراد الأسرة PRMT أعرب بتواجد مطلق. وليتم اختبار الأنشطة ترانسفيراز thyl من PRMT1 تنقيته في وقت لاحق الراس GTPase تفعيل البروتين البروتين 1 (G3BP1) ملزمة، ركيزة PRMT معروف، في حضور S-أدينوزيل-L- [ميثيل 3 H] ميثيونين كما المانح الميثيل. يمكن استخدام هذا البروتوكول ليس فقط لإنشاء وضع ركائز جديدة مثيلة من PRMT1 الفسيولوجية، ولكن أيضا لفهم الآلية الأساسية من البروتين أرجينين مثيلة.
Introduction
وكان أول وصف مثيلة البروتين في عام 1968 1. لم يكن حتى استنساخ أول من PRMT1 في عام 1996، أن الباحثين بدأوا نقدر أهمية هذا التعديل بعد متعدية 2. ومن المثير للاهتمام، الميثيلي وحوالي 2٪ من بقايا أرجينين في البروتينات مقتطفات النووية 3، مما يدل على وفرة من هذا التعديل. أرجينين هو حمض أميني موجبة مع سلسلة الجانبية الأساسية والنيتروجين / س في غضون السلاسل الجانبية للأرجينين يمكن أن يكون بعد translationally تعديل عن طريق إضافة مجموعة الميثيل، وهي عملية تعرف باسم أرجينين مثيلة 4-6. يتم تحفيز أرجينين مثيلة من قبل فئة من الإنزيمات وهي، transferases البروتين الميثيل أرجينين (PRMTs). Arginines يمكن أن تكون إما monomethylated أو dimethylated وهذا الأخير يمكن أن يكون إما متماثل أو غير متماثل تبعا لنوع من PRMTs تحفيز عملية 4-6.
البروتينات التي تعرض argininزخارف الإلكتروني جليكاين الغنية هي أهداف محتملة لبوساطة PRMT الحفز. وقد تبين بوساطة PRMT مثيلة من ركائز لتعديل التفاعل البروتين البروتين، البروتين النووي تفاعل حامض، وظيفة البروتين، والتعبير الجيني، و / أو الإشارات الخلوية، والتي تعتبر بالغة الأهمية لالتوازن الخلوي العادي 7-9. من أجل فهم الدور البيولوجي للبروتين أرجينين مثيلة، يطلب فحوصات دقيقة وفعالة، وقابلة للتكرار لإنشاء مركز مثيلة من ركائز PRMT تحديدها.
في المختبر فحص الحامض، الذي يقيم قدرات PRMTs تنقيته لتحفيز مثيلة من ركائز بهم، هو فحص مقبولة تماما لدراسة مثيلة أرجينين 10-12. النجاح الشامل لهذا الاختبار يعتمد إلى حد كبير على نشاط PRMTs المنقى. ويمكن التعبير عن PRMTs وتنقيته من البكتيريا، أو خلايا الثدييات 10،11. هذا الفحص في المختبر مثيلة، ودetailed في قسم البروتوكول، وبناء على الطريقة الموصوفة في الأصل من قبل تيني وزملاؤه 10. في هذا البروتوكول، وتبين لنا بالتفصيل الخطوات المتبعة في التعبير وتنقية PRMT1 في خلايا الثدييات. تم تقييم قدرة PRMT1 تنقيته لتحفيز مثيلة على رأس GTPase تفعيل بروتين بروتين ملزمة 1 (G3BP1)، وPRMT الركيزة المعروف 8، في وقت لاحق وجود S-أدينوزيل-L- [ميثيل 3 H] ميثيونين باسم المانحة الميثيل. باستخدام هذا الاختبار، يمكننا تحديد موثوق قدرات PRMTs لرواية ميثيل أو ركائز معروفة، وهي الخطوة الأولى في دراسة البروتين أرجينين مثيلة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم استخدام بروتوكول الموصوفة هنا بشكل روتيني لتحديد الوضع مثيلة من ركائز PRMT تحديدها. وهذا الاختبار قوي، ومتماسك تقدم أيضا دليل قاطع على خصوصية PRMTs لركائز بهم. المكونات الرئيسية لنجاح هذا الاختبار هي: 1. التعبير عن PRMTs في خلايا الثدييات، 2. آخر من PRMTs المنقى، 3. التعبير و…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة من قبل جائزة تقدير من وزارة الخارجية الامريكية للشؤون المحاربين القدامى، والمعاهد الوطنية للصحة منح R01CA138528 إلى RW.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine | Perkin Elmer | ||
| Ecoscint ultra | National Diagnostics | LS-270 | |
| Bottle top dispenser | National Diagnostics | LS-900 | |
| AutoFluor | National Diagnostics | LS-315 | |
| 6 ml Scintillation Vials | National Diagnostics | SKU:SVC-06 | |
| GST-sepharose | GE Life Sciences | ||
| L-Glutathione Reduced | Sigma | G4251 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | Transfection reagent | |
| Beas2B | ATCC | ||
| Optimem | Invitrogen | ||
| NP-40 | US-Biologicals | ||
| SDS | Sigma | ||
| Sodium deoxycholate | Sigma | ||
| PMSF | Sigma | ||
| anti-HA affinity matrix | Roche | ||
| Tris | Sigma | ||
| Nacl | Sigma | ||
| Bio-rad gel doc | Bio Rad | ||
| anti-HA antibody | roche | ||
| Ponseau S | Fisher Scientific |
Referências
- Paik, W. K., Kim, S. Protein methylase I. Purification and properties of the enzyme. J Biol Chem. 243, 2108-2114 (1968).
- Lin, W. J., Gary, J. D., Yang, M. C., Clarke, S., Herschman, H. R. The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with a protein-arginine N-methyltransferase. J Biol Chem. 271, 15034-15044 (1996).
- Boffa, L. C., Karn, J., Vidali, G., Allfrey, V. G. Distribution of NG, NG,-dimethylarginine in nuclear protein fractions. Biochem Biophys Res Commun. 74, 969-976 (1977).
- Bedford, M. T. Arginine methylation at a glance. J Cell Sci. 120, 4243-4246 (2007).
- Lee, Y. H., Stallcup, M. R. Minireview: protein arginine methylation of nonhistone proteins in transcriptional regulation. Mol Endocrinol. 23, 425-433 (2009).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Mol Cell. 33, 1-13 (2009).
- Bikkavilli, R. K., et al. Dishevelled3 is a novel arginine methyl transferase substrate. Scientific reports. 2, 805 (2012).
- Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. Arginine methylation of G3BP1 in response to Wnt3a regulates {beta}-catenin mRNA. J Cell Sci. 124, 2310-2320 (2011).
- Bikkavilli, R. K., Malbon, C. C. Wnt3a-stimulated LRP6 phosphorylation is dependent upon arginine methylation of G3BP2. J Cell Sci. , (2012).
- Tini, M., Naeem, H., Torchia, J. Biochemical analysis of arginine methylation in transcription. Methods Mol Biol. 523, 235-247 (2009).
- Lee, J., Cheng, D., Bedford, M. T. Techniques in protein methylation. Methods Mol Biol. 284, 195-208 (2004).
- Cheng, D., Vemulapalli, V., Bedford, M. T. Methods applied to the study of protein arginine methylation. Methods Enzymol. 512, 71-92 (2012).
- Zurita-Lopez, C. I., Sandberg, T., Kelly, R., Clarke, S. G. Human protein arginine methyltransferase 7 (PRMT7) is a type III enzyme forming omega-NG-monomethylated arginine residues. J Biol Chem. 287, 7859-7870 (2012).
