在体外甲基化分析研究蛋白质精氨酸甲基化
Summary
蛋白质精氨酸甲基化，由一类酶即催化。蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs），是酶促加入甲基组（S），以蛋白质内精氨酸的过程。 在体外甲基化测定法是最可靠的工具，以评估已知的或新型的PRMT底物的甲基化状态。
Abstract
蛋白质精氨酸甲基化是在细胞核中最丰富的翻译后修饰之一。蛋白质精氨酸甲基可以被识别和/或通过蛋白质组的方法来确定，和/或以甲基精氨酸特异性抗体进行免疫印迹。然而，这些技术有时可能会产生误导，并经常提供假阳性结果。最重要的是，这些技术不能提供支持的PRMT底物特异性的直接证据。 体外甲基化分析，在另一方面，是有用的生化分析，这是敏感的，并且始终如一地揭示，如果所识别的蛋白确实PRMT底物。一个典型的体外甲基化检测包括纯化的活性PRMTs，纯化的底物和放射性同位素标记的甲基供体（S-腺苷-L-甲基- 3 H] –甲硫氨酸）。在这里，我们描述了一个一步一步的协议隔离催化活性PRMT1一个广泛表达PRMT家族成员。在我纯化PRMT1的基苯乙基转移酶活性上的Ras-GTP酶激活蛋白结合蛋白1（G3BP1），一种已知的PRMT底物后进行测试，在S-腺苷-L-甲基- 3 H] –甲硫氨酸作为甲基供体的存在下进行。这个协议可以采用不仅用于建立的新的生理PRMT1基板的甲基化状态，而且对于了解蛋白质精氨酸甲基化的基本机制。
Introduction
蛋白甲基化是在1968年1首先描述。直到PRMT1在1996年的第一个克隆，研究人员开始欣赏这种翻译后修饰2的重要性。有趣的是，约2％精氨酸残基在核提取物中的蛋白质被甲基3，说明本变形例的丰度。精氨酸是一种带正电荷的氨基酸与碱性侧链和氮/ s的精氨酸的侧链中可以在翻译后通过加入甲基，称为精氨酸甲基4-6的过程的修改。精氨酸甲基化的一类酶即催化，蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）。精氨酸既可以单甲基化或二甲基化，而 后者可以是对称或不对称的视PRMTs催化过程4-6的类型。
这显示精氨酸的蛋白质E-甘氨酸丰富的图案是PRMT介导的催化潜在目标。基板的PRMT介导的甲基化已显示调节蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质-核酸相互作用，蛋白质功能，基因表达，和/或细胞信号，所有这些都对正常细胞稳态7-9关键。为了理解的蛋白质精氨酸甲基化的生物作用，精确，高效和可重复的试验，需要建立所标识的PRMT底物的甲基化状态。
在体外甲基化检测，评估其纯化PRMTs的能力，以促进它们的底物的甲基化，是研究精氨酸甲基化10-12广为接受检测。此测定法的总体成功在很大程度上依赖于纯化的PRMTs的活性。 PRMTs可以表示和从细菌或哺乳动物细胞10,11纯化。此体外甲基化检测，为detailed的协议部分，是基于最初由蒂尼和他的同事10中描述的方法。在这个协议中，我们显示了详细涉及PRMT1在哺乳动物细胞中的表达和纯化的步骤。纯化PRMT1的催化甲基上的Ras-GTP酶激活蛋白结合蛋白1（G3BP1），一种已知的PRMT底物8的能力中的S-腺苷-L-甲基- 3 H] –甲硫氨酸的存在下作为后来评价甲基供体。使用这种方法，我们能够可靠地限定PRMTs的能力甲醇新颖的或已知的底物，这是在蛋白质精氨酸甲基化的研究的主要步骤。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文所描述的协议通常用于建立所标识的PRMT底物的甲基化状态。这一功能强大且一致的分析也将提供PRMTs其底物的特异性确切的证据。关键部件的该测定法的成功是：PRMTs在哺乳动物细胞中的表达1，2，活性纯化的PRMTs的，3的表达和衬底的纯化和蛋白质的4完全西方转印到硝酸纤维素膜上。
重组PRMTs表达，并从细菌中纯化的，也可以在体外甲基化反应10,11,13使用。…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究是由美国退伍军人事务的美国国防部优异奖的支持，以及美国国立卫生研究院授予R01CA138528到RW。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine | Perkin Elmer | ||
| Ecoscint ultra | National Diagnostics | LS-270 | |
| Bottle top dispenser | National Diagnostics | LS-900 | |
| AutoFluor | National Diagnostics | LS-315 | |
| 6 ml Scintillation Vials | National Diagnostics | SKU:SVC-06 | |
| GST-sepharose | GE Life Sciences | ||
| L-Glutathione Reduced | Sigma | G4251 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | Transfection reagent | |
| Beas2B | ATCC | ||
| Optimem | Invitrogen | ||
| NP-40 | US-Biologicals | ||
| SDS | Sigma | ||
| Sodium deoxycholate | Sigma | ||
| PMSF | Sigma | ||
| anti-HA affinity matrix | Roche | ||
| Tris | Sigma | ||
| Nacl | Sigma | ||
| Bio-rad gel doc | Bio Rad | ||
| anti-HA antibody | roche | ||
| Ponseau S | Fisher Scientific |
Referências
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